啤酒活性干酵母凝血质提取研究田小海王莘摘要[目的]研究并优化啤酒活性干酵母凝血质的提取工艺。[方法]生长曲线法确定其培养时间，采用L9（34）正交试验设计，应用低温和葡聚糖凝胶（SephadexG-75）对凝血质进行纯化。[结果]啤酒活性干酵母最佳培养时间为9d，凝血质提取优化工艺参数为乙醇浓度85%、提取温度35℃、第1次丙酮体积（丙酮∶粗提液）为0.7、恒温磁力搅拌器转数为600r/min，凝血质提取量可以达到1000mL活化液0.660g，纯化率为13%。[结论]从啤酒活性干酵母可提取凝血质，方法简单易实现，降低凝血质动物来源的生成成本，具有极大的应用价值。关键词啤酒活性干酵母;凝血质;提取;纯化TS262.5+4A0517-6611（2019）03-0147-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.047凝血系统是人体发挥内源性或外源性凝血途径的物质基础，凝血物质一般可分为经典凝血和激肽2个系统[1]。凝血质属于经典凝血系统中的凝血因子Ⅲ，当凝血因子Ⅲ与其受体Ⅶa结合后，可通过启动外源性凝血途径而发挥凝血作用[2]。凝血质来源较为广泛，主要有中药、动物和微生物等。前人的研究主要集中在2种来源的凝血质的提取，一种是从中药中进行凝血质分离和提取，另一种是从试验动物的血液中进行提取和纯化。中药来源的凝血质分离提取过程复杂、纯化困难，获取量少限制了其应用;动物源性的凝血质为优质凝血质，但难于从动物体内大量获得，试验动物获取凝血质生产成本较高，也限制了其应用;微生物来源的凝血质主要存在于半知菌纲的真菌中，啤酒活性干酵母中凝血质含量丰富，容易扩大培养，分离提取及纯化工艺相对容易，是获得凝血质的理想来源，但微生物来源的凝血质的提取研究较少。笔者主要通过对啤酒活性干酵母的生长曲线的测定确定凝血质提取的时间，通过醇浸提，脱水后乙醚提取，再通过丙酮沉淀的方法进行研究，达到优化提取方案的目的。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种。湖北安琪酵母公司提供安琪啤酒活性干酵母。1.1.2试剂。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、铁粉、琼脂、蒸馏水、不同浓度的乙醇、无水硫酸钠、乙醚、丙酮、考马斯亮蓝G-250、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、二巯基乙醇、四甲基乙二胺、过硫酸铵、盐酸、甘氨酸、磷酸盐缓冲溶液等。1.1.3仪器。高压蒸汽灭菌箱、光照培养箱、无菌操作台、恒温水浴箱、多循环水式真空泵、恒温磁力搅拌器、摇床、离心机、分析天平、摇床、pH计、旋转蒸发仪、冷冻干燥机、分光光度计（可见光和紫外光）、冰箱、超声波振荡器、电泳仪、SephadexG-75。1.1.4培养基。活化培养基[3]：葡萄糖2.5g、蒸馏水100mL，121.3℃，103.4kPa，灭菌20min。斜面培养基：葡萄糖40g、蛋白胨和琼脂各10g、酵母膏5g，加水至500mL，121.3℃，103.4kPa，灭菌20min。液体发酵培养基[4-5]：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母膏5g、KH2PO45g、MgSO4·7H2O2g、微量Fe粉，加水至500mL，121.3℃，103.4kPa，灭菌20min。1.2方法1.2.1啤酒活性干酵母活化和扩大培养[4-6]。1.2.1.1菌种活化。2.5g葡萄糖置于250mL三角瓶中，加水100mL，溶解后于电炉加热煮沸，冷却至35℃，即得活化液，121.3℃，103.4kPa，灭菌20min。啤酒活性干酵母0.2g，35℃条件下加入活化液中，自然冷却至30℃后，置于30℃水浴中活化2h。1.2.1.2斜面保存。取活化后菌种，在无菌操作台进行斜面接种，培养7d，冷藏保存备用。1.2.1.3扩大培养。取适量冷冻保存的菌种，接入40mL（250mL三角烧瓶）液体发酵培养基中，于28～30℃摇床振荡（150r/min）培养24h，可用于凝血质的提取分离。1.2.2啤酒活性干酵母生长曲线的测定[7]。250mL活化液分别对生长1～12d的啤酒活性干酵母进行测定，从培养24h后开始，每间隔24h收集一次菌体，由于离心效果差，采用静置沉降的方法收集菌体[8]，测定前采用200目筛网对发酵液进行过滤，50℃以下对过滤得到的菌体进行烘干处理后进行称重，根据称重结果以发酵天数为横坐标、干菌体量为纵坐标绘制曲线，即为生长曲线。1.2.3啤酒活性干酵母凝血质的提取方法[9]。啤酒活性干酵母干菌体在一定温度下，通过一定浓度的乙醇浸提，获得提取液;提取液在一定温度下经过浓缩，获得膏状物;膏状...