应用SELDI技术建立尿毒症患者筛选血清蛋白质指纹图谱模型【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672-3783(2011)12-0030-01【摘要】目的:建立尿毒症患者筛选血清蛋白质指纹图谱模型。方法:用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)及CM10蛋白芯片获得尿毒症患者和健康者血清的蛋白质指纹图谱,用计算机软件进行比较分析，建立尿毒症的筛选模型。结果：尿毒症患者与健康对照组血清蛋白质指纹图谱之间有5个标志蛋白(6946Da,6543Daz11743Da,6076Da,6749Da)在尿毒症患者血清中高表达，1个标志蛋白(8703Da)在尿毒症患者血清中低表达。SELDI-TOF-MS技术的特异性(38/40,95%),敏感度(36/40,90%).分析系统筛选岀6543Da、6076Da、8703Da>11743Da标志蛋白建立尿毒症的诊断模型。结论：建立的血清蛋白质指纹图谱模型能够区分尿毒症患者与健康者,SELDI-TOF-MS在尿毒症的诊断及特异性蛋白质生物标志分子的筛选等方面具有一定价值。【关健词】表面增强激光解析电离飞行时间质谱;蛋白芯片；尿毒症尿毒症是肾功能衰竭的最严重阶段，病情严重,死亡率高。在我国的发病率每年每百万人口中新发生的尿毒症患者约占1%,其中80%为青壮年，严重影响了人们的健康和生命安全。肾衰早期，往往无临床症状，而仅表现为基础疾病的症状，因此早期发现、早期治疗是预防进入尿毒症期的最有效方法。我们利用美国Ciphergen公司生产的表面增强激光解吸离子化时间飞行质谱(surfaceenhancedlaserdesorption/ionization)技术对尿毒症患者和健康志愿者血清中的蛋白质进行对比分析，采用生物信息学方法建立可作为尿毒症诊断标志的蛋白质组合样式，寻求可用于临床尿毒症早期诊断的特异性生物标记物。1材料与方法1.1材料所有尿毒症患者血清样品均为2004-08至2006-06台州市立医院的门、住院患者,40例，其中男30例，年龄35-60岁,女10例，年龄45-64岁，符合尿毒症诊断标准[1],对照样品来自经健康查体正常的志愿者40例，其中男30例，年龄40-68岁；女10例，年龄40-65岁。在10ml血清分离管中全血采集，于-4°C4000r/min离心10min.取30PI血清分装在0.5ml离心管中，于-70°C冰箱保存.美国赛弗吉公司的表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪(SurfaceEnhancedLaserDesorptionIonization-timeOFFlight-MassSpectrometry,SELDI-TOF-MS)及该公司配套CM10(弱阳离子交换)芯片.主要试剂：尿素、乙月青、三氟乙酸等均购自Sigma公司，SPA⑸napinicAcid)购自CiphergenBiosystems公司.U9缓冲液(9mol/LUrea,20g/LCHAPS,10g/LDTI；50mmol/LTris-HCI,pH9.0),U1缓冲液(用50mmol/LTris-HCI缓冲液9倍稀释U9缓冲液),CM10缓冲液(100mmol/L乙酸钠pH4.0)。1.2方法血清经冰浴融化后4°C20000r/min离心10min•取201H血清，加30PIU9缓冲液，4°C振摇20min,再加100uIU1缓冲液，4°C震荡30min.每个芯池中加150uICM10缓冲液，振荡孵育5min2次.从上述蛋白变性后的血清样品中取50ul,力口200UICM10缓冲液稀释，加至CM10芯片的Bioprocessor中,振荡60min,甩去血清标本，每孔加150UICM10缓冲液，振荡孵育5min2次，最后芯片用20mmol/LHEPES(Ph7.4)淋洗，晾干芯片.芯片每孔分2次加SPA0.5Ul,两次之间自然晾干。质谱仪参数设定为激光强度220,灵敏度7,优化范围800-20000质荷比(m/z)o每条芯片取1点用同一正常人血清作内参照，芯片间CVW10%.检测前用ALL-IN-ONE多肽标准芯片校正，系统质量偏差W0.1%.原始数据先以Proteinchip3.0软件校正。统计学处理采用CiphergenProteinChip软件和BioMarkerWizard软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质质荷比数据按数据挖掘要求进行处理，用BiomarkerWizardSoftware3.1软件和BiomarkerPatternsSoftware4.0.1软件对数据进行分组及相关性分析，比较两组之间蛋白质峰强度时,P［2-4］,尤其在一些癌症的诊断上，如前列腺癌［5］、卵巢癌［6］、乳腺癌［7］的诊断上。从血清中寻求特异性生物标记物用于尿毒症等诊断是目前临床急需解决的难题。本研究是采用SELDI-TOF-MS技术通过比较蛋白质组学研究，发现一些敏感性和特异性均较高，且易于临床检测的新的生物标志物。我们采用CM10蛋白质芯片对40例尿毒症患者和40例健康者的血清...