PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节初探作者：高宇琳，张海方，邹昕，杜鸿，夏秋风，生秀梅，徐顺高，黄新祥【摘要】目的：探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响。方法：应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株；利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术，比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异，并选择部分差异表达基因进行RTRCR验证。结果：经PCR及序列分析证实，伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备成功；基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期有81个基因表达上调，有22个基因表达下调。结论：PmrA在伤寒沙门菌高渗应激后期的基因表达调节中发挥重要作用。【关键词】伤寒沙门菌；PmrA；高渗应激；基因芯片［Abstract］Objective:ToexploretheinfluenceofPmrAongeneexpressionregulationofS.entericaseroverTyphiatlaterstageofhyperosmoticstress.Methods：ThepmrAdeletedmutantofS.entericaserovarTyphiwaspreparedbyhomologousrecombinationmediatedbysuicideplasmid.ThehyperosmoticstressenvironmentwassimulatedbyincreasingtheconcentrationofNaClintheLBfrom50mmol/Lto300mmol/Linvitro,andgeneexpressionprofilesofwildtypeandpmrAdeletedmutantofS.entericaserovarTyphiatlaterstageofosmoticstresswereinvestigatedbyS.entericaserovarTyphigeneomemicroarrayanalysis.RTPCRwasperformedtoprovetheresultsofmicroarrayinsomeselectedgenes.Results：PCRandsequencinganalysisdemonstratedthatthepmrAdeletedmutantofS.entericaserovarTyphihadbeenconstructedsuccessfully;geneexpressionprofilesanalysisrevealedthatexpressionof81genesand22geneswereincreasedanddecreasedrespectivelyinthepmrAmutantatlaterstageofhyperosmoticstress.Conclusion：Theregulator,PmrAofS.entericaseroverTyphi,wasimportantingenesexpressionregulationinresponsetohyperosmoticstress.［Keywords］S.entericaseroverTyphi;PmrA;hyperosmoticstress;microarray伤寒沙门菌（SalmonellaentericaserovarTyphi）是沙门菌属中一种人类严重的肠道致病菌，已成为一种重要的原核生物基因表达与信息调控研究的模式菌。目前在沙门菌和埃希菌（Escherichiacoli）中已发现数十种双组分调节系统［1］，PmrAB是其中研究较多的一种，属于经典的二元双组分调节系统---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---［2］。目前研究表明沙门菌PmrAB的活化信号主要有高铁离子（Fe3+）、铝离子（Al3+）、酸性pH（如pH5.5）、钒酸盐［3-5］和低镁离子（Mg2+）［6］,低镁离子的活化是通过PhoPQ系统促进pmrD的表达来实现的。近年来，基因芯片技术的发展为全面、高效观察基因表达提供了一个极佳的策略。我们利用沙门菌基因组寡核苷酸芯片进行的相关研究表明，伤寒沙门菌在高渗应激的早期（30min）、中期（60min）、后期（120min)与持续稳态高渗（高渗过夜培养）下的基因表达明显不同，许多侵袭相关的基因在高渗应激后期有明显上调，并首次发现在高渗应激后期pmrA的表达明显下调［7］。这些结果提示在高渗应激下伤寒沙门菌的基因表达调节机制十分复杂，存在网络化交叉调节作用，PmrAB系统可能对高渗应激特别是应激后期的基因表达调节有重要的影响。因此，本文利用伤寒沙门菌基因组芯片进行表达谱分析，旨在研究在高渗应激后期PmrA调节因子对其他基因表达调控的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株和质粒伤寒沙门菌GIFU10007、大肠埃希菌E.coliSPY372λpir、自杀质粒pGMB151由日本岐阜大学医学院微生物学教研室惠赠；大肠埃希菌E.coliDH5α，E.coliλ372由本室保存。1.1.2主要试剂限制性内切酶BamHI，SalI，T4DNA连接酶、碱性磷酸酶，ExTaq，TA克隆试剂盒均为TaKaRa（大连）公司产品；胶回收试剂盒为Promega公司产品；荧光染料Cy3，Cy5为AmershamPharmaciabiotech公司产品；总RNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品；反转录试剂盒为Invitrogen公司产...