过量表达Bacillussubtilis磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶对大肠杆菌产琥珀酸的影响于丽姜岷*马江锋岳方方刘树文(南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室江苏南京210009)摘要:在大肠杆菌厌氧混合酸发酵途径中,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)皆可催化由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)到草酰乙酸(OAA)的反应。鉴于经由PCK催化的反应伴有ATP的生成,理论上更有利于菌体生长和产酸,本研究以大肠杆菌W3110(△pfl,△ldh)为出发菌株,利用λ-Red同源重组系统构建了其ppc缺陷菌株并在此基础上过量表达了Bacillussubtilispck基因。初步的厌氧发酵实验表明:过量表达pck可在一定程度上恢复初始菌株厌氧代谢葡萄糖的能力。其中又以ppc缺陷株更为明显,其耗糖能力和产酸能力分别为对照菌株的4.2和15.3倍。关键词:磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,大肠杆菌,琥珀酸EffectofOverexpressionofBacillussubtilisPhosphoenolpyru-vateCarboxykinaseonSuccinateProductioninEscherichiacoliYULiJIANGMin*MAJiang-FengYUEFang-FangLIUShu-Wen(StateKeyLaboratoryofMaterials-OrientedChemicalEngineering,CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing,Jiangsu210009,China)Abstract:Bothofthephosphoenolpyruvatecarboxylase(PPC)andphosphoenolpyruvatecarboxykinase(PCK)couldcatalyzethereactionfromphosphoenolpyruvate(PEP)tooxaloaceticacid(OAA)inthepath-waysofanaerobicmixedacidfermentationforE.coli.Inaddition,thereactioncatalyzedbyPCKgeneratesATP,whichismorebeneficialtothegrowthofthestrainandthesuccinicacidproductiontheoretically.Inthisstudy,weconstructedappcdefectivestrainusingλ-RedhomologousrecombinationsystemwiththeE.coliW3110(△pfl,△ldh)astheparentstrain.Basedonthat,Bacillussubtilispckwasoverexpressed.Thepreliminaryanaerobicfermentationexperimentsshowedthatbothstrainspartiallyrecoveredtheabilitytoconsumeglucosethroughtheoverexpressionofpck.Besides,theppcdefectivestrainshowedthemostex-cellentperformance,therateofglucoseconsumptionandsuccinateproductionwere4.2and15.3foldsasmuchasthoseoftheparentstrain,respectively.Keywords:Phosphoenolpyruvatecarboxykinase,Phosphoenolpyruvatecarboxylase,E.coli,Succinicacid琥珀酸(又称丁二酸),被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业,同时,作为优秀的C4平台化合物,可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料,被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一[12]。利用微生物发酵法转化可再生资源生产琥珀酸,价格低廉、污染小,且在发酵过程中可吸收固定---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---CO2,开辟了温室气体利用的新途径,近年来成为研究的热点。琥珀酸的生产菌株很多,目前主要集中在Anaer-obiospirillumsucciniciproducens[3]、Actinobacillussuc-cinogenes[4]、Mannheimiasucciniciproducens[5]和重组E.coli上。其中,E.coli由于具有遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点,近年来被广泛用于研究以获得产琥珀酸优秀菌株。图1[6]显示了大肠杆菌的厌氧混合酸发酵途径。产琥珀酸大肠杆菌基因改造策略主要有:增强代谢途径中的关键酶(如PPC)、失活或敲除竞争途径中的酶(如LDH、PFL)、引入新的代谢途径(如乙醛酸循环)等[7]。图1大肠杆菌厌氧混合酸发酵途径[6]Fig.1PathwaysofanaerobicmixedacidfermentationforEscherichiacoli[6]其中,PEP羧化酶(PPC)基因(ppc)和PEP羧化激酶(PCK)基因(pck)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与草酰乙酸(OAA)之间的反应。Millard等[8]在大肠杆菌中过量表达E.colippc和pck,研究发现过量表达ppc可以使琥珀酸作为混合酸发酵的主要产物,且产量较出发菌株提高3.5倍,而过量表达pck对发酵结果没有影响,但在ppc...
