基于Red重组系统对HCMVBACTowneUL49基因的改造#赵高翔，周天鸿**510152025303540（暨南大学生命科学技术学院，广州510632）摘要：本研究以HCMVBACTowne为平台，利用Red同源重组技术，首先通过阿拉伯糖进行诱导表达相应的重组酶，然后将线性的带有同源臂的RPSL-Neo正负筛选框电转化进入含有HCMVBACTowne和PKD46质粒的DH10B宿主菌中，使带有同源臂的线性rpsl-neo正负筛选表达框与相应的目的基因发生同源重组，从而替换掉UL49基因。替换成功的菌利用其在卡那霉素中可以生长，而在链霉素中却不能生长的特性，将构建成功的菌进行初步的筛出，再经过PCR及测序进一步鉴定，鉴定正确的菌命名为BAC-Towne-DL49。成功构建了缺失表达HCMVUL49基因的新的HCMVBACTowne，为后续的转染细胞提供了一个有效的载体，为进一步研究HCMVUL49的功能奠定了基础。关键词：人巨细胞病毒；BAC；同源重组；UL49基因；缺失突变中图分类号：Q78RenovationofHCMVBACTowneUL49geneviaRed-mediatedrecombinationsystemZHAOGaoxiang,ZHOUTianhong(CollegeofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,GuangZhou510632)Abstract:HCMVBACTownewascommittedtoresearchinthistopicbyRed-recombinationsystems.TheexpressionofgenesmediatingRedrecombinationwasfirstinducedbytheadditionofL-arabinose.Then,thelinearrpsl-neocounter-selectioncassetteflankedbyhomologousarms“hm”waselectroporatedintotheDH10BE.colistraincarryingHCMVBACTowneandPKD46plasmid.AndRedrecombinationinsertedthefunctionalcassetteintothetargetlocus.OnlycoloniescarryingthemodifiedBACwillsurvivekanamycinselectionontheagarplatesandbecomestreptomycinsensitive.Thesuccessfulintegrationofthecounter-selectioncassettewillbemonitoredbyPCRandDNAsequencing.ThecorrectcolonieswerenamedwithBAC-Towne-DL49.WehavesuccessfullycontructedaUL49-deletionmutantrecombination.AndtherecombinantHCMVBACTownewouldbeabletolayfoundationfortheresearchofHCMVUL49genefunction.Keywords:HCMV;BAC;Homologousrecombination;UL49gene;Deletionmutant0引言人巨细胞病毒（humancytomegalovirus,HCMV）是人群中普遍存在的一种病原体，通常呈不显性或潜伏感染的状态。在免疫功能低下的个体，如器官移植、其他免疫调节型病毒感染（HIV）等，HCMV感染常会导致非常严重的疾病；在新生儿，HCMV被认为是智力损伤、听力丧失等先天性疾病的主要致病因素之一[1,2]。HCMV自身毒力较弱，但病毒基因一旦整合到受精卵细胞的相关基因后，则可阻止或影响后者的复制和表达，导致不可逆的形态和结构异常，会引起严重的后果。因此对HCMV的研究具有非常重要的现实意义。HCMV常见有AD169、Towne、Toledo三种实验株，它们是经过HCMV反复感染细胞后分离得到的，它们已经丧失了在人体内复制和扩散的能力，不具有致病性，但在体外细胞基金项目：国家自然科学基金项目（No.90608024）作者简介：赵高翔，（1986-），男，在读硕士研究生，分子生物学。通信联系人：周天鸿，（1956-），男，教授，博导，病毒基因组功能。E-mail:tzth@jnu.edu.cn-1-培养中仍具有繁殖功能，为HCMV研究的最常用模式株。本研究针对HCMVTowne病毒株，为了研究病毒基因的功能，为此对特定基因进行改造构建突变病毒株是一种重要的手段，但4550是由于HCMV基因组巨大的特点，传统的分子克隆技术很难对其进行改造。近年来，随着含有HCMV基因组的细菌人工染色体（BacterialArtificialChromosome，BAC）的成功构建和基于λ噬菌体Red系统的同源重组技术的广泛应用[3]。对HCMV单个基因进行表达分析已经成为了解其体内功能的重要手段之一并发展到了一个新的阶段。本研究基于Red的同源重组技术，对含有HCMVTowne全基因组的BAC进行改造，为进一步研究UL49基因功能奠定基础。1材料和方法1.1主要材料及试剂1.1.1菌株和质粒大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α及含有HCMVBACTowne的宿主菌DH10B由本实55验室保存。载有HCMVTowne全基因组序列的BAC-Towne质粒和PKD46质粒均由美国加州大学Berkeley分校Liu惠赠...