非霍奇金淋巴瘤造血干细胞移植病人的微量肿瘤细胞检测关键词：淋巴瘤，非霍奇金氏；造血干细胞；肿瘤循环细胞/诊断中分类号：R733；R457文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)04-0304-03大剂量放、化疗后进行自体骨髓移植(ABMT)或外周血干细胞移植(PBSCT)治疗高危或复发非霍奇金淋巴瘤(NHL)已取得良好疗效，但复发仍是治疗失败的主要原因。越来越多的证据表明，体内残留或回输的肿瘤细胞可导致复发，缩短病人的生存期［1～4］。因此，检测体内和移植物中残留的微量肿瘤细胞具有重要的临床意义。常规的形态学检查仅在肿瘤细胞达到5%以上时才能得到阳性结果［5］。近年发展的PCR等分子生物学技术通过测定基因重排能在105～106个正常细胞中检测到1个肿瘤细胞［2～4］，从而使微量肿瘤细胞的检测成为可能。本文就NHL常见的基因标志、检测方法及临床意义作一综述，重点讨论微量肿瘤细胞检测在NHL病人自体造血干细胞移植中的应用。一、NHL的基因标志1.肿瘤细胞特异性基因标志由于染色体易位形成的基因重排，为肿瘤细胞所特有，可作为肿瘤特异性基因标志。如NHL中，常见由t(14；18)形成的bcl-2/IgH、t(11；14)形成的bcl-1/PRAD-1及t(8;14)形成的myc/IgH基因重排，分别见于滤泡型及少数弥漫性大细胞型淋巴瘤，外套细胞型淋巴瘤，小无核裂细胞型及Burkitt's淋巴瘤，但大部分NHL并无这类基因标志，因此其临床应用范围有限。2.肿瘤细胞克隆特异性基因标志淋巴细胞在分化成熟的过程中要进行免疫球蛋白重链(IgH)或T细胞抗原受体(TCR)基因重排，重排的DNA序列具有较高的多态性及细胞克隆特异性，正常及反应性淋巴细胞为多克隆性基因重排，淋巴瘤为单克隆性(偶有寡克隆)基因重排，据此可区分正常细胞与肿瘤细胞。由于IgH和TCR克隆性基因重排几乎见于所有淋巴系统恶性肿瘤，故具有重要的应用价值。二、微量肿瘤细胞的检测方法1.非分子生物学的方法采用形态学检查或分裂中期细胞染色体核型分析，敏感性仅为1%～10%，难以查知微量肿瘤细胞。免疫表型分析可将敏感性提高到0.1%。细胞培养的方法不仅能证实瘤细胞的存在，而且能推测这些细胞是否具有体内增殖、导致复发的能力，敏感性为1/104，但缺点是所得结果难以重复［6］。2.分子生物学的方法Southernbolt是最早用于肿瘤基因诊断的分子生物学技术之一。克隆性IgH、TCR重排及bcl-2/IgH等融合基因均可用此法检测，检测的敏感性为1%～5%［7］。此方法有诸多缺点，如：操作复杂、有同位素污染、所需模板DNA量大且完整，故近年来已逐渐被PCR技术所取代。与Southernblot相比，PCR方法敏感、简便、快速，仅需较少量DNA做模板，无论新鲜标本，或长期保存的石蜡包埋组织及骨髓、外周血涂片皆可进行检测。检测的敏感性可达到1/105～1/106。但以共有引物PCR方法测定淋巴瘤克隆性IgH、TCR基因重排时，因正常淋巴细胞产生的多克隆背景干扰，敏感性下降。为了克服这种干扰，提高检出率，可采取下列措施：a.对来自肿瘤组织的PCR产物测序，合成克隆特异性的寡核苷酸探针或引物，再用这一探针或引物检测微量肿瘤细胞。此法检测克隆性IgHCDR3重排的敏感性可达1/104。由于要对每个病人的PCR产物测序，合成各自的克隆特异性探针或引物，难度大、花费高，故不适合广泛的临床应用［3］。b.PCR与DNA单链构象多态性(SSCP)分析结合，能在多克隆重排背景下检出单克隆IgH重排，敏感性为1/1000～2/1000，也可在此基础上快速克隆和测序，合成克隆特异性引物以检测更微量的肿瘤细胞［8］。c.PCR与温度梯度凝胶电泳(TGGE)结合。传统的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)仅根据片段大小分辨DNA，TGGE通过两套独立的冷热水循环系统在电泳槽上制造线性的温度梯度，在给定的温度下双螺旋DNA片段部分解链，产生非配对的碱基，影响其电泳速率。在TGGE时同质双螺旋体较异质双螺旋体泳动快，从而得到一种特异的带型。此法已成功地应用于IgH及TCR基因重排的分析。巢式PCR与TGGE结合，可在103～105个正常细胞中检出一个肿瘤细胞［9，10］。d.PCR与变性梯度凝胶电泳(DGGE)结合。DGGE在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿素做变性剂，当双链DNA片段泳动至某一凝胶区域，该区域的变性梯度与DNA片段的低温融解...