过氧乙酸TAE缓冲液对硫修饰DNA切割条件的优化

上海交通大学学报JOURNALOFSHANGHAI激AOTONGUNIVERSITY:1006-2467(2008)014)005-06过氧乙酸-TAE缓冲液对硫修饰DNA切割条件的优化梁晶丹,汪志军,周秀芬,邓子新(上海交通大学生命科学技术学院,上海200030)摘要:用乙酸和过氧化氢反应生成的过氧乙酸(PAA)辅配三轻甲基氨基甲烷-乙酸-EDTA(TAE,pH7.5)对疏修饰DNA的切割条件进行了优化.用6mmol/L的PAA-TAE处理硫修饰基因组和质粒DNA,30min可使降解程度达到最大饱和.用60mmol/L的PAA-TAE经20h处理低熔点琼脂椅包埋的菌丝体DNA,得到最佳切割效果.用PAA-TAE验证了一株在脉冲场凝胶电泳过程中基因组DNA降解的Salmonella菌株的Dnd表型;同时验证其廣粒激活降解与已经验证的Streptomyceslividans质粒激活降解一样为位点专化性疏修饰.关键词:疏修饰DNA;过氧乙酸-三理甲基氨基甲烷■乙酸-EDTA;激活;DNA降解:Q555.4文献标识码:ADNAModificationbySulfur:AnalysisofDndPhenotypebyPeraceticAcid-TAETreatmentLIANG激ng-dan»WANGZhi-jun«ZHOUXiu-fen«DENGZi-xin(SchoolofLifeScienceandBiotechnology♦Shanghai激aotongUniversity^Shanghai2000301China)Abstract:ThispapertestedtheuseofPAAcombinedwithTAE(PAA-TAE)asacleavingagenttoanalyzetheDndphenotypeofthesulfurmodifiedchromosomalandplasmidDNA.A6mmol/LPAA-TAEconcentrationfor30mintreatmentwasfoundtobeoptimal.ForcleavageofchromosomalDNAinplugs,thebesttreatmentwas60mmol/LPAA-TAEfor20h.TheDndphenotypeofSalmonellaserovarTyphi-murium87•ofwhichthechromosomalDNAwasalsofounddegradedduringpulsefieldgelelectrophoresiswhenanalyzedbyPAA-TAEtreatment9wasreproduciblyobtained.Keywords:DNAmodification;peraceticacid-trisaceticacidEDTA;activated;DNAdegradation早在20世纪80年代初期•对链霉菌Streptomyceslividans9Streptomycesavermitilis基因组DNA进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)时,发现它们发生降解•实验证实:这种现象,并不是由于实验操作不当•如污染了核酸酶所至•因为EDTA.蛋白酶K.高温等处理并不能抑制这种降解•而一定浓度的含有硫的还原剂却能够抑制它⑴•将这种基因组DNA在电泳过程降解的基因表型称为Dnd(DNADegradationPhenotype).研究表明,决定Dnd表型的基因位于S.lividans染色体上一段93kb的基因岛上口⑶.进一第42卷第1期2008年1月Vol.42No.1Jan.2008收稿日期:2007-01-12基金項目:国家自於科学基金资助项目(30630001)作者算介:鑿晶丹(1969-).女•黑龙江齐齐哈尔市人•博士生,主要研究DNAM化修饰•汪志军<1968),男•上海人•讲拜•邓子新(联系人几男•教授•博士生导芽•电话(Tel.)l02b62933404;E-mail:zxdeng@sjtiLedu.cn.ft两个作者在比研究中为同等贡献.步精确定位,确定了决定Dnd表型的一段3kb的DNA序列,多重序列比对分析结果显示其含有5个基因,为可双向转录的基因簇:dndK和Jn^BCDE.对dnd基因簇的中断以及回补实验表明,这个3kb长的“加基因簇决定了S.livi-dans的Dnd表型序列比对表明・/“/基因簇的多个基因与硫的代谢相关⑶.同时•体内的放射性硫喂养示踪实验表明,硫的放射性信号可以掺入到野生型菌株S.lividans基因组DNA中•而作为对照的93kb突变株ZXl^或整个dnd基因簇中断株HXY6却没有观察到放射性信号的掺入⑶.说明,Dnd表型与DNA的一种含有硫的全新的修饰有关.这种硫修饰具有位点特异性,非随机发生•通过对S.lividans中的pUlOl质粒上修饰位点的研究发现•修饰优先发生在某些位点,同时,也存在修饰频率较低的修饰位点.修饰位点的优先性受修饰位点周围3个正向重复的DNA顺序的影响对于造成DNA在电泳过程中降解的外部原因的研究•是由PaulDyson实验室⑷完成的.通过实验证明,电泳过程中阳极的乙酸氧化产生了过氣乙酸(PAA)和电泳缓冲液中的一级胺比如Tris(三轻甲基氨基甲烷)共同形成双功能试剂导致了硫化修饰的DNA断裂.用PAA复配三起甲基氨基甲烷-乙酸-EDTA(TAE)对硫修饰DNA进行Dnd表型鉴定,成为一种可行的替代方案•硫修饰DNA的Dnd表型是在PFGE过程中发现的LH.用PFGE可以鉴定Dnd表型•但是实验过程操作繁琐,...

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