caspase-3在颈椎稳定性异常小鼠脑组织中表达的变化及其意义(白城医学高等专科学校吉林白城137000)【】R965【文献标识码】A【】1007-8231(2016)26-0086-02颈椎病是开始于单个或多个颈椎间盘的进行性退行性病变，并可导致周围骨和软组织的结构改变，影响相关血管、神经根或/和脊髓，患者常伴头痛、血压升高、心率增快，老年病人常伴组织器官衰老病症。为深入探讨颈椎稳定性异常导致脑细胞凋亡机制，采用免疫组化、逆转录聚合酶链反应和Westernblot观察caspase-3蛋白在在小鼠颈椎稳定性异常病理模型⑴脑组织中的表达变化，探讨颈椎稳定性异常与AD发病的分子生物学机制。1.主要试剂配置和方法1.1主要试剂的配制PBS溶液：称取氯化钠、0.2g氯化钾I、1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾溶于800ml蒸憾水，用HCI调节溶液pH值至7.4,加蒸惚水定容至1L。0.01M柠檬酸缓冲液：3g柠檬酸三钠+0.4g柠檬酸溶入1000ml蒸憾水，用0.1M氢氧化钠溶液调定pH至6.0o4%多聚甲醛溶液：40g多聚甲醛溶于lOOOmIPBS溶液,加热溶解。DAB配$lj：1ml蒸憾水中加入一滴浓缩缓冲液，均匀混合；滴加DAB溶液和浓缩过氧化氢溶液各一滴，再次混匀，避光保存，30分钟内使用。Hams苏木素染色液：用200ml蒸憾水加热溶解15g硫酸铝钾，用10ml无水乙醇溶解匹苏木精，再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸憾水中，煮沸1分钟后，稍冷却，慢慢加入0.5g红色氧化汞，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用前滤纸过滤后每100ml加冰醋酸lOmlo1.2RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳1.2.1总RNA提取每组取双侧海马和皮层组织各lOOmg(每组4只小鼠，每只鼠取25mg)置5ml离心管，加lml预冷异硫氧酸弧变性溶液，匀浆。加O.lmlNaAc(2mol/L,pH4.0),1ml酚■氯仿■异丙醇混合液，震荡，4°C10000g离心20mino吸取上清，加等容积异丙醇,・2O°C放置2h以上,4°ClOOOOg离心15min0吸去上清。向沉淀中加0.5ml变性溶液，搅拌至RNA溶解。加NaAcO.OSml,酚■氯仿■异戊醇混合液0.5ml,震荡,4°ClOOOOg离心20mino上层水相转移到1.5ml离心管中，加等容积异丙醇，・20°C放置2h以上，4°C、lOOOOg离心15mino以预冷的75%乙醇5ml洗涤沉淀，并按前法离心。吸去乙醇，在真空干燥器中干燥沉淀15min,用0.3〜0.5mlDEPC水溶解RNA沉淀。紫外分光光度计测定(260/280)nm吸光值，估算RNA样品纯度。RNA浓度(mu;g/ml)=OD260值40mu;g/ml稀释倍数。1.2.2引物设计从Genebank中找到小鼠Capase-3的全长cDNA序列，并利用Primer5.0和Oligo6.0软件设计引物。以beta;-actin做内参用于RT・PCR。经检验引物内部无发夹结构，引物之间无二聚体形成，引物与基因库之间无非特异性同源区域。1.2.3逆转录反应合成cDNA在0.5mlEppendorf管中加入：①取总RNA10mu;g加DEPC水至12.5mu;l；②加入Olig-dT(lmu;g/mu;l)2.5mu;l；③混匀后置65°C水浴10分钟,冰浴2mim④另取一个0.5mlEppendorf管加入5RT-bufferl0mu;l,dNTP(10mM)2.5mu;l,MMLV(100U/mu;l)2.0mu;l,灭活DEPC水21.5mu;l；⑤将④混匀后加入③中，42°C水浴lh,70°C水浴10分钟灭活逆转录酶；⑥逆转录所得cDNA模板放于・20°C保存备用。1.2.4PCR反应扩增设置反应程序：94°C变性1分钟,55°C退火1分钟，72°C延伸1.4分钟，共34个循环，最后72°C延伸10分钟。反应总体积25mu;l：CDNA2.5mu;l,2TaqPCRPlusMixl2.5mu;l,primerl.Omu;l,ddH20；9.0mu;l。混匀，进行PCR。反应结束后，拿出样品取5ulPCR产物在2%琼脂糖凝胶板上电泳，电压50V约20分钟。电泳条带跑开后，将琼脂糖凝胶用图像分析仪行图像分析。2.结果2.1caspase-3蛋白免疫组织化学染色模型组较正常对照组脑海马、额叶和颍叶caspase-3阳性细胞数均明显增多,大小形态均一，说明颈椎稳定性异常可致脑组织caspase-3表达上调。见图1。图1小鼠脑海马区caspase-3蛋白免疫组织化学染色结果(1040)(左正常组，右模型组)2.2半定量RT-PCR产物的电泳图谱模型组caspase-3基因表达较正常对照组明显上调，见图2。图2caspase-3半定量RT-PCR产物的电泳图谱模型组脑组织caspase-3含量(0.379plusmn;0.045)明显高于正常对照组(0.320plusmn;0.002),差异有显著性(P<0.01)o2.3Westernblot实验模型组小鼠脑组织中caspase-3蛋白表达高于正常对照组，...