TMTMTM第27卷第6期水生生物学报Vol.27,No.62003年11月ACTAHYDROBIOLOGICASINICANov.,2003斜带石斑鱼阿片黑素促皮质素原全长cDNA克隆及序列分析张为民1张利红1马广智2张勇1(1.中山大学生命科学学院,广州510275;2.华南师范大学生命科学学院,广州510631)摘要:通过构建斜带石斑鱼垂体cDNA文库和随机测序,克隆了其阿片黑素促皮质素原(Proopiomelanocortin,POMC)全长cDNA。斜带石斑鱼POMC全长cDNA为863bp(含Poly(A)),编码的POMC多肽前体为219aa。氨基酸序列比较分析表明:斜带石斑鱼POMC前体包含有促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropin,ACTH),α-促黑素(α-melanocytestim-ulatinghormone,α-MSH),β-促黑素(β-MSH),γ-促脂素(γ-lipotrophichormone,γ-LPH),β-内啡肽(β-endorphin)等,但缺失了γ-促黑素(γ-MSH)和大部分连接区。斜带石斑鱼POMC与哺乳动物POMC的同源性为39%—42%左右,与鸟类的同源性为42%左右,与两栖类的同源性为36%—41%,与其他鱼类POMC的同源性为38%—77%。斜带石斑鱼和罗非鱼的POMC的ACTH功能区都为40个氨基酸残基,而其他脊椎动物为39个氨基酸残基。关键词:斜带石斑鱼;阿片黑素促皮质素原;cDNA克隆:Q45文献标识码:A:1000-3207(2003)06-0625-06阿片黑素促皮质素原(POMC)是动物脑和垂体中多种活性肽类的共同前体,如ACTH,MSH,β-内啡肽等。在动物体内,这些活性肽类是通过POMC基因的组织细胞特异性表达和加工而产生,如在垂体前叶ACTH细胞中,POMC被加工为ACTH和β-促脂素(β-LPH),而在垂体中叶的促黑素细胞中POMC被加工为α-MSH,类促肾上腺皮质素中叶肽(Cortico-tropin-LikeIntermediatelobePeptide,CLIP),β-LPH和β-内啡肽[1]。这些活性肽类在动物的应急、摄食和能量代谢等的调节中起着重要作用[2,3]。目前POMC的基因已从多种不同动物中克隆,它是一种存在于所有脊椎动物的前腺垂体激素前体。在脊椎动物中,鱼类POMC基因最具有多样性。在辐鳍鱼类的进化过程中,POMC中的γ-MSH区域不断退化,以至在真骨鱼类中γ-MSH区域完全消失[4]。在一些软骨鱼类中,除存在α-、β-、γ-MSH外,还发现有[5,6]1材料与方法1.1组织样品4龄斜带石斑鱼(Epinephelusco-ioidesHamilton)购自广东省水产厅大亚湾鱼种增殖中心的海水养殖基地。垂体取出后立即置于液氮中,带回实验室保存在-80℃。1.2试剂和酶SMARTTMcDNALibraryConstructionKit购自CLONTECH公司。总RNA提取试剂TRIzo-lReagent和反转录酶SuperScriptⅡ购自GIBCO-BRL公司。包装文库所用的包装蛋白MaxPlaxTMLambdaPackagingExtract购自EPICENTRETECHNOL-OGIES公司。质粒提取和胶回收试剂盒为OmegaBiotek产品。除特别注明外,其余均为国产分析纯试剂。1.3斜带石斑鱼垂体总RNA的提取将垂体置于0.5mLTRIzolTMReagent中,用注射器匀浆后,根据厂δ-MSH,因此,深入研究鱼类POMC基因,对于阐家提供的方法提取总RNA,并电泳检测RNA质量。明脊椎动物POMC的进化,以及ACTH,MSH和β-内啡肽等的结构与功能有着重要的意义。斜带石斑鱼是我国南方重要的海水养殖鱼类,具有很高的经济价值。本文对斜带石斑鱼POMC全长cDNA进行了克隆和序列分析,以期为进一步探讨POMC对其应急、摄食和能量代谢等的调节奠定基础。1.4斜带石斑鱼垂体cDNA文库的构建取1μg垂体总RNA,根据SMARTTMcDNALibraryConstructionKit介绍的方法构建cDNA文库。1.5斜带石斑鱼POMCcDNA的克隆根据SM-ARTcDNALibraryConstructionKit所介绍的方法,将噬菌体λTriplEx2重组片段转入到质粒pTriplEx2收稿日期:2002-12-17;修订日期:2003-01-03基金项目:国家高新技术计划(863)海洋生物功能基因组开放实验室项目;国家自然科学基金项目(No.30070598)资助作者简介:张为民(1966—),男,江西万载人;副教授;研究方向:鱼类内分泌学与分子生物学,Email:ls68@zsu.edu626水生生物学报27卷中,用牙签随机挑取平板上70个阳性单克隆,提取质粒DNA,进行序列测定。所获得序列通过BlastP与GenBank中的序列进行同源性比较分析。脊椎动物POMC氨基酸序列多重比较以及进化树构建均采用软件ClustalX(1.8)进行。进化树显示采用软件TreeView(1.6.6)。1.6斜带石斑鱼POMC中间区域RT-PCR分析为了验证斜带石斑鱼POMC中γ-MSH的缺失不是由于...