丹玄口康对槟榔提取液刺激下的人口腔黏膜成纤维细胞增殖及增殖细胞核抗原表达的影响作者：李元聪谭劲陈安彭楚湘【摘要】：目的观察丹玄口康对槟榔提取液(ArecaNutExtract,ANE)诱导的人口腔黏膜成纤维细胞(Fibroblasts,FB)的增殖及增殖细胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)表达的影响。方法体外培养人口腔黏膜FB,100μg/mLANE为诱导剂,10%大鼠丹玄口康药物血清为干预物；用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法测定细胞增殖速度,用免疫细胞化学法检测PCNA的表达。结果MTT显示,丹玄口康组的OD值低于ANE刺激组(P《0.01或P《0.05),丹玄口康组免疫阳性细胞数及相对灰度值均低于ANE刺激组(P《0.01或P《0.05)。结论丹玄口康能够抑制ANE刺激下的人口腔黏膜FB的增殖,下调PCNA的表达。【关键词】丹玄口康槟榔提取液成纤维细胞增殖细胞核抗原Abstract：ObjectiveTostudytheeffectofDanxuanKoukang(DXKK)drugserumonproliferationandproliferatingcellnuclearantigen(PCNA)productionofhumanoralmucosalfibroblasts(FB)inducedbyarecanutextract(ANE).MethodsHumanoralmucosalFBwereculturedinvitro,100μg/mLANEwasusedasinducementand10%DXKKdrugserumasintervenor.ThecellproliferationratesweremeasuredbyMTTassay,PCNAproductionswereexaminedbyimmunocytechemistry.ResultsMTTassayshowedODvalueinDXKKgroupsweresignificantlydecreasedcomparedwiththeinducedgroup(P《0.01orP《0.05).ImmunocytechemistryshowedcountsandrelativegreyvalueofPCNA–positivecellsinDXKKgroupsweresignificantlydecreasedcomparedwiththeinducedgroup(P《0.01orP《0.05).ConclusionDXKKcaninhibitproliferationandPCNAproductionofhumanoralmucosalFBinducedbyANE.Keywords：DanxuanKoukang；arecanutextract；fibroblasts；proliferatingcellnuclearantigen口腔黏膜下纤维化(OralSubmucousFibrosis,OSF)是一种以胶原纤维堆积为主要病变特征的慢性隐匿性疾病,以口腔硬化、张口受限为主要特征。目前普遍认为咀嚼槟榔与OSF发病密切相关,但其发病机理仍不十分清楚,治疗尚无成熟方法。本研究从中医整体出发,利用现代实验手段,研究丹玄口康对口腔黏膜成纤维细胞(FB)增殖及相关因子增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响,旨在进一步阐明该方药作用的物质基础,揭示该方药抗OSF的作用机理,为临床治疗提供实验依据。---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---1材料与方法1.1主要仪器、试剂及药物二氧化碳培养箱(M2300,美国),酶标仪(MK3,芬兰),DMEM培养基(GIBCO),二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT,Sigma),二甲基亚砜(DMSO,Sigma产品),PCNA免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；槟榔提取液(ANE),按文献方法[3]制备；丹玄口康片,湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供,批号20050208；显微镜(Motic),图像分析系统(MoticImagesAdvanced3.2)。1.2丹玄口康药物血清的制备成年健康SD大鼠30只,随机分为3组：正常组、丹玄口康低剂量组和丹玄口康高剂量组,每组10只,分别以生理盐水、丹玄口康4、12g/kg(按照体表面积药物剂量换算公式计算,分别相当70kg成人剂量的1、3倍)灌胃,2次/d,连续5d。大鼠末次灌胃1h后,无菌条件下颈动脉采血,室温静置2h,1500r/min离心10min制备血清,56℃灭活30min,0.22μm滤器除菌后,用DMEM配制成含10%大鼠血清的培养液备用。1.3成纤维细胞的培养与槟榔提取液诱导成纤维细胞增殖的浓度人口腔黏膜FB的培养与鉴定按我们前期实验[1]介绍的方法进行,并根据前期实验结果确定诱导FB增殖的ANE浓度为100μg/mL。用第3～4代细胞进行试验。1.4细胞分组第1组为正常对照组：10%正常大鼠血清；第2组为ANE刺激组：10%正常大鼠血清＋100μg/mLANE；第3组为丹玄口康低剂量组：10%低剂量丹玄口康含药血清＋100μg/mLANE；第4组为丹玄口康高剂量组：10%高剂量丹玄口康含药血清＋100μg/mLANE。1.5MTT法检测成纤维细胞增殖活性细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板中,每组设复孔6个,培养48h后弃培养液,用无血清DMEM培养液洗后,每孔加入含5mg/mLMTT的200μL无血清DMEM培养液,...