类风湿关节炎患者血清中纳米细菌检测及鉴定[摘要]目的探讨类风湿关节炎患者和正常人群血清标本中纳米细菌分布情况。方法对30例正常人群和30例类风湿关节炎患者血清进行纳米细菌培养，用钙染色技术对培养物进行纳米细菌检测，采用间接免疫荧光法进行纳米细菌鉴定。结果30例正常人和30例类风湿关节炎患者血清纳米细菌的检出率分别为6.7%（2株）、30.0%（9株），两者间差异有统计学意义（χ2=2.919，P=0.02<0.05）。结论类风湿关节炎患者血清中存在纳米细菌，提示纳米细菌感染与类风湿关节炎发病可能有关。[关键词]类风湿关节炎；纳米细菌；间接免疫荧光染色；血清[]R593.22[文献标识码]B[]1673-9701（2013）02-0085-02类风湿性关节炎是一种关节滑膜组织增生、炎症细胞集聚、关节软骨退变等病理特征慢性关节疾病，主要由炎症细胞及炎症因子介导。一直以来对类风湿性关节炎病因的探讨大多围绕自身免疫反应和微生物感染因素进行。1990年芬兰科学家Kajander发现一种直径较小、可以通过100nm滤菌器的细小微粒，认为这种微粒是一种新型原核微生物，命名为Nanobaeteria[1]。本实验中我们采用钙染色法和间接免疫荧光法研究类风湿关节炎患者和正常人群血清中纳米细菌的感染情况。1资料与方法1.1临床资料收集2010年1月1日～2011年12月31日我院骨关节科30例类风湿关节炎患者血清30份和门诊30例正常人血清30份，男28例，女32例，年龄30～68岁，平均46岁。1.2仪器与试剂Axiostarplus购自德国蔡司有限公司，ThermoFomaCO2孵育箱购自美国ThermoFisherScientific公司，RPMI1640细胞培养基和γ射线照射过的胎牛血清购自GIBCO公司，FITC标记山羊抗小鼠IgG购自北京华夏远洋科技有限公司，鼠抗纳米细菌单克隆抗体购自芬兰NanobacOY公司。1.3方法1.3.1标本培养将待测血清标本通过0.22μm和0.45μm无菌滤菌器，制备成纳米细菌菌悬液。将0.1mL菌悬液注入含10%γ射线照射过的胎牛血清RPMI1640培养基瓶中，37℃和5%CO2条件下孵育4周。将10%γ射线照射过的胎牛血清RPMI1640培养液加入生理盐水作阴性对照，每周观察并记录生长情况。1.3.2茜素红钙染色①将血清标本培养菌液滴至载玻片上，自然晾干，用95%乙醇和乙醚固定15min，无菌水洗后70℃烤箱中10min。②无菌蒸馏水冲洗3遍，每遍2min。③用2%茜素红钙染液染4～5min。④无菌蒸馏水速洗。⑤0.2%淡绿水溶液复染20～30s。⑥0.5%醋酸水溶液速洗。⑦用95%乙醇和100%乙醇脱水。⑧待烘干后用二甲苯透明中性树胶封固，油镜观察。1.3.3间接免疫荧光法鉴定（IIFS）①将血清标本培养菌液滴至载玻片上，自然晾干，用95%乙醇和乙醚固定15min，无菌蒸馏水洗后70℃烤箱中10min。②无菌蒸馏水冲洗3遍，每遍2min。③滴加一抗鼠抗纳米细菌单克隆抗体8D10，37℃孵育60min，PBS冲洗3次，每次2min。④加入FITC标记山羊抗小鼠IgG，37℃孵育40min，用PBS再次冲洗3次，每次2min。⑤80%甘油封片，置于荧光显微镜Axiostarplus下观察。PBS替代鼠抗纳米细菌单克隆抗体8D10作为阴性对照。1.4统计学分析采用SPSS13.0软件，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。2结果本研究60例血清标本培养4周后肉眼可见有11瓶培养液轻度混浊，可见灰白色颗粒状沉淀出现，最大者直径约0.3mm。许多白色结晶颗粒粘附瓶壁。见图1。纳米细菌茜素红钙染色：普通光镜下可见纳米细菌的矿化外壳被茜素红染成红色，视野中布满了红色小颗粒，见图2。间接免疫荧光法染色：纳米细菌与单克隆抗体8D10抗体产生特异性结合见图3，图3可见绿色荧光的纳米细菌。阴性对照未见绿色荧光物质。类风湿关节炎患者和正常人群之间血清中纳米细菌检测结果比较：30例正常人的血清中有2例纳米细菌感染，其阳性率为6.7%；30例类风湿关节炎患者血清中有9例纳米细菌感染，其阳性率为30.0%，差异有统计学意义（P<0.05），说明类风湿关节炎患者血清中存在着纳米细菌感染。见表1。3讨论纳米细菌革兰染色阴性球杆菌，可以通过0.22μm滤菌器，直径为50～500nm。纳米细菌可在PRMI1640和DMEM培养基中生长，生长环境以条件5%CO2和95%空气为最佳。纳米细菌可聚集于哺乳细胞周围并被其吞噬，产生细胞毒性作用。纳米细菌具有独特的矿化能力，...