内科学(心血管病)专业优秀论文血管损伤修复中CCN1对EPCs功能的影响及其机制研究关键词：血管内皮损伤血管损伤修复CCN1基因基因表达内皮祖细胞血管新生内膜摘要：1.背景与目的血管内皮损伤是经皮冠脉介入术(percutaneouscoronaryintervention，PCI)血管再狭窄及支架内血栓形成的核心[1]，也是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等多种血管性疾病共同的病理生理基础[2-4]。内皮的有效再生是抑制血管平滑肌的异常增生和防止血栓形成的关键[5]。因此，尽早促进受损血管再内皮化、恢复内皮功能，俨然是抑制血管损伤不良修复，预防或防治血管再狭窄及血栓形成的有效策略。传统观念认为内皮损伤的修复仅仅依靠邻近内皮细胞的迁移和增殖。近年的大量研究发现内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是机体促进内皮有效再生以及血管良性修复的重要内在机制[6-9]。现已证明，EPCs在体内微环境的作用下能够分化成有功能的内皮细胞，参与缺血组织的血管新生并整合到损伤血管壁的新生内膜中参与损伤血管的再内皮化[10-13]。然而，目前对于调控EPCs增殖、迁移和分化的机制及某些关键因子在其中的作用尚不完全清楚。CCN1是近年发现的一种分泌型基质信号蛋白[14]，广泛参与分化、发育、肿瘤生长等多种病理生理过程的调控[15-18]。已有研究表明：1)胚胎发育过程中CCN1基因缺陷将导致胎盘血管生成减少以及分支障碍，引起胚胎死亡[21]。2)成年后CCN1的表达与血管性疾病如动脉粥样硬化、原发性高血压、肿瘤血管新生等密切相关[22-25]；CCNI还参与了皮肤、骨骼、肝脏等多种组织的再生修复过程[26-28]。3)在体外，CCN1能促进大鼠角膜及兔股动脉缺血后的血管新生，并对血管内皮细胞的增殖、迁移及管样形成能力均有促进作用[29-33]。4)CCN1在骨髓间充质干细胞(MSCs)的增殖、分化、迁移中发挥重要调控作用，并诱导CD34+细胞的迁移和归巢[33-35]。提示：CCN1可能在EPCs介导的血管新生及血管损伤修复中发挥重要作用。因此在本课题中，我们将从整体动物和和细胞水平探讨CCN1在EPCs增殖、迁移、分化以及血管损伤修复中的作用及其机制。期望为深入认识CCN1的生物学功能及EPCs的调控机制提供新的实验依据，为进一步促进血管损伤后内皮再生、血管良性修复提供新的思路和策略。2.方法2.1重组腺病毒Ad-CCNl和Ad-Id1的构建从大鼠组织提取RNA，经RT-PCR扩增得到目的基因CCN1和Id1片段，通过pMD19T-Simple和AdEasy细菌内同源重组系统构建CCN1和Idl的病毒过表达载体，分别命名为Ad-CCN1和Ad-Id1，经过测序、PCR和酶切鉴定重组病毒Ad-CCN1和Ad-Id1的构建。2.2观察CCN1在血管损伤修复过程中的表达及作用用1-2月龄的雄性SD大鼠复制颈动脉球囊损伤模型，通过荧光定量RT-PCR以及Westernblot分别观察CCN1在血管损伤修复过程中mRNA和蛋白表达水平的变化：然后向损伤血管组织转染Ad-CCN1，观察过表达CCN1对损伤后4、7、14、21天血管再内皮化以及新生内膜增厚的影响。2.3CCN1对EPCs增殖、迁移和分化的作用通过密度梯度离心及选择性培养的方法在体外分离、培养大鼠骨髓源EPCs，经过细胞形态学、表面分子标志以及Dil-acLDL/FITC-UEA-I双阳性鉴定后，转染Ad-CCNl以及含CCNlshRNA的重组质粒pGenesil-CCNl.以观察过表达或沉默CCN1基因对EPCs增殖、迁移、分化的作用。2.4探讨CCN1作用于EPCs增殖、迁移和分化的分子机制2.4.1利用GEArray公司的DNA芯片初步分析Ad-CCNl作用后48小时对EPCs基因表达的影响，筛选CCN1作用的可能下游靶点；2.4.2检测Ad-CCN1作用下负性转录调控因子Id1在转录、蛋白表达水平的变化，并通过Ad-Id1与Ad-CCN1的共转染实验观察Id1对Ad-CCN1诱导的EPCs分化的影响，以明确Id1是否参与介导Ad-CCNl对EPCs分化的调控作用。3.结论3.1CCN1在球囊损伤的大鼠颈动脉组织动态高表达；过表达CCN1显著促进大鼠球囊损伤早期血管再内皮化程度；过表达CCN1抑制大鼠球囊损伤第14天血管新生内膜的增厚；3.2过表达CCN1基因促进EPCs的迁移和分化；沉默CCN1基因抑制EPCs的增殖、迁移和分化；3.3过表达CCN1诱导EPCs中20个基因表达的显著变化；3.4过表达CCN1抑制Idl在EPCs的表达；Id1至少部分抑制CCN1对EPCs分化的促进作用。正文内容1.背景与...