HansiXMiMedicalDiagnosis映学诊断，2012,2,7-11http://dx.doi.org/10.12677/md.2012.22002PublishedOnlineJune2012(http://www.hanspub.org/joumal/md)TheMolecularCloningandBioactivityCharacterizationofCalmodulinfromMedicinalFungusAgrocybeaegeritaYiLiang,HuiSun.1・.2DepartmentofClinicalImmunology,GuangdongMedicalCollege,Dongguan'TheCollegeofLiteSciences,WuhanUniversity,WuhanEmail:liangyi@gdmc.edu.cnReceived:Mar.29th,2012;revised:Apr.9th,2012;accepted:Apr.24th,2012Abstract:Objective:Theantitumor-associatedgeneofAgrocybeaegeritawasclonedtoidentifythebioactivity・Method:eDNAlibrarywasconstructedandthegenecalmodulinwasobtainedbyrandomsequencing・Theeukaryoticexpressionvectorwasconstructedtodetectcellapoptosisandsenescenceactivity.Result:Thecalmodulingenewasclonedwith588bpscodefor150aminoacidresidues,andtheaminoacidsequencewasveryconservedincalmodulinfamily.TheexpressionofclonedgeneinHeLacellsdidnotinducethecellapoptosisorsenescence.Conclusion:Thesequenceofcalmodulincontainedconservedmotifandbelongedtocalmodulinfamily.Keywords:MedicinalFungus;CaM;cDNASequence药用真菌杨树菇钙调素基因及活性初步鉴定一，孙慧I广东跃学院检验学院，临床免疫教研室，东莞2武汉大学生命科学学院，武汉Email:liangyi@gdmc.edu.cn收稿日期：2012年3月29日；修回曰期：2012年4月90；录用曰期：2012年4月24日摘要：目的：克隆杨树菇抗肿瘤相关蛋白基因，初步鉴定其活性。方法：构建cDNA文库，随机测序得到杨树菇钙调素(calmodulin,CaM)基因，并对其进行牛物信息学分析，通过检测其在HeLa细胞中表达引起的细胞凋亡及衰老的变化，初步鉴定其抗肿瘤活性。结果：得到全氏为588bp的杨树菇钙调素cDNA序列，编码150个氨基酸，其氨基酸序列在整个钙调素家族中十分保守。钙调素基因在真核细胞中表达没有引起肿瘤细胞的凋亡和衰老。结论：杨树菇钙调素序列具有CaM保守序列模式，是CaM家族的成员。关键词：药用真菌；CaM；cDNA序列1•引S药用真菌因其独特的药理活性被越来越多的研究者关注冋。其中蛋自质组分古子或祐干重约10%〜40%,但长期以來，仅有上百种蛋白/多肽被分离，且多嗪中在对其氨基酸组成、活性分析等初步研究。己有I•多种药用真菌蛋白被报道具很强的抗肿瘤活性5M级)[5.61,提示除多糖外，蛋白质是药用真菌中[7]另一类重要的抗肿瘤活性组分。然而由于药用真菌基因组信息缺乏，不易克隆蛋白基因序列，药用真菌的抗肿瘤活性蛋白研究十分不足目前随着高通量测序技术的成熟，国内外学者也都致力于对药用真菌基因组的测序工作，极大地推动了药用真菌活性蛋白的研究。在Z前的研究中，杨树菇Agrocybeaegerita活性蛋白在体内和体外试验中均表现出显著的抗肿瘤活性丁本文通过构建cDNA文库测序的方法，克隆药用真菌杨树菇抗肿瘤活性相关基因并对其活性做初步筛选，为研究抗肿瘤蛋白提供理论基础。2•材料与方法2.1.材料杨树菇Agrocybeaegerita子实体山华中农业大学食用菌研究所培育，品种为杨树菇3号，釆集之后迅速冷冻于液氮罐中保存。RNA提取试剂盒是Qiagen公司的RNeasyPlantMiniKit,SMARTcDNALibraryConstructionKit购于Clontech公司。真核表达载体pGEFP-Cl系本实验室保存，HcLa细胞购于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）,转染试剂为invitrogcn公司的Lipofectamine2000o衰老相关//-galactosidase检测试剂盒购自上海杰美生物公司，碘化丙锭PI购于武汉大风生物技术有限公司。2.2.cDNA文库及基因测序使用RNeasyPlantMiniKit提取杨树菇子实体总RNA,按照SMARTcDNALibraryConstructionKit说明书构建cDNA文库。即在合成cDNA的反应中事先加入的3,末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA,在到达mRNA的末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC）,SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物...