多西紫杉醇对人大肠癌H「29细胞增殖及凋亡的作用朱海成赵宝忠邱运梅朱元廷（牡丹江市肛肠医院黑龙江牡丹江157013）【中图分类号】R979.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）15-0094-02【摘要】目的探讨多西紫杉醇（docetaxel）对人大肠癌细胞增殖的抑制作用。方法应用MTT法和流式细胞术检测不同浓度的多西紫杉醇作用HT-29细胞后增殖抑制率、细胞周期及凋亡率。结果多西紫杉醇对HT-29细胞增殖有抑制作用，且呈时间一浓度量效依赖性，随浓度增加，细胞周期亦有明显变化，凋亡率逐渐上升，用药组之间比较差异显箸。结论多西紫杉醇可抑制大肠癌HT-29细胞增殖，改变细胞周期且诱导凋亡。【关键词】多西紫杉醇大肠癌增殖抑制/凋亡木研究旨在探讨多西紫杉醇对体外培养人大肠癌HT-29细胞的牛长的影响，为其在临床的实用提供理论依据。1材料与方法1丄材料人大肠癌细胞株HT—29（中国科学院上海牛物细胞研究所）;多西紫杉醇（法国安万特公司）；四甲基偶氮卩坐蓝MTT（Sigma）；RPMI1640培养基（Gibco）；小牛血清（杭州四季青生物材料研究所）;FACScant型流式细胞仪（美国Becton-Dickinson公司产品）。1.2仪器与设备C02培养箱（日木三洋）；超净工作台（苏州苏净集团安泰公司）；倒置荧光显微镜（日木0LYMPUS）；酶标自动分析仪BIO-RAD550型（美国）；台式离心机（eppendorf公司）；电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；1.3方法1.3.1细胞培养:细胞培养在含有10%小牛血清的RPMI1640培养液中，加入青霉素100u/L,链霉素100mg/L,置于37°C,5%CO2培养箱中培养，每3d〜4d用0.25%胰酶消化传代1次，取对数生长期细胞用于实验。1.3.2多西紫杉醇对细胞生长的影响实验组中分别加入含多西紫杉醇1.25-40&mu;g/ml,每组设6个复孔，对照组加等量的培养液。连续培养242实验结束前4h每孔加入20&mu;IMTT液显色，继续培养4h后每孔加入200&mu;IDMSO,用酶标仪测定570nm处各孔的吸光度数值，计算抑制率=（对照组平均A值一实验组平均A值/对照组平均A值）&times;100%o1.3.3细胞形态观察取对数生长期的HT・29细胞换含不同浓度的多西紫杉醇的培养液培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况。制备细胞爬片标本，常规HE染色。1.3.4流式细胞仪检测细胞周期各吋相的变化选择对数生长期HT・29细胞，调整细胞数为3&times;105个/ml接种6孔培养板中，每孔2ml,24h后更换含有2.5、5、10、40&mu;g/ml多西紫杉醇的培养液，每组6个复孔，培养24小吋后制成单细胞悬液，离心，弃上清，用4°C预冷的70%冷乙醇固定，4°C保存，固定。800rpml5分钟收集固定的细胞，PBS洗2次；用0.5mlPBS重悬细胞并转至试管中轻轻吹打；Rnase-A至终浓度约50&mu;g/ml,37°C水浴30分钟；加PI至终浓度为65&mu;g/ml,避光染色30分钟，过滤，用FACSort流式细胞仪上机检测，细胞增殖抑制率（PCI）：PCI=[（对照组S+G2M-用药组S+G2M）&divide;对照组S+G2M]&times;100%o1.4统计学处理本实验数据采用X&plusmn;s表示，应用SPSS软件进行统计学分析。2结果2.1多西紫杉醇对HT・29细胞生长的抑制作用于药物处理后24h采用MTT法测得各组的抑制率（IR）,结果表明：多西紫杉醇在2.5-10&mu;g/ml浓度范围内对HT・29细胞均有抑制作用，药物浓度越高，作用时间越长，其抑制作用越明显（表1）。表1多西紫杉醇对结肠癌HT・29细胞增殖的影响（X&plusmn;s）组别浓度（&mu;g/ml）0D值抑制率％对照组00.542&plusmn;0.068/给药组1.250.487&plusmn;0.06210.0152.50.389&plusmn;0.050*28.15650.237&plusmn;0.044*56.147100.135&plusmn;0.035*75.806*与对照组比较P<0.012.2细胞形态的观察结果对照组细胞生长旺盛，呈高折光率，胞体大，胞浆内未见颗粒，常聚性生长，随吋间延长变化不人，多西紫杉醇组细胞增殖减慢，随药物浓度增大和时间延长，细胞逐渐变小，折光率减弱，部分脱落漂浮于培养瓶。2.3多西紫杉醇对细胞周期及凋亡率的影响流式细胞仪分析结果表明,多西紫杉醇作用24小吋吋，能使结肠癌HT・29细胞的G1期细胞增多，使S期和M期的细胞明显减少，细胞增殖抑制率与对照组相比明显增高（PV0.05）,随着多西紫杉醇浓度的增加，HT-29细胞增殖抑制率逐渐增加，表现为量效依赖性（...