人内皮抑素小环载体的构建及其在真核细胞中的表达

中山大学学报(医学科学版)JOURNALOFSUNYAT-SENUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES)人内皮抑素小环载体的构建及其在真核细胞中的表达徐本玲*,吴江習S薛刚2,赵鹏'•肖林',黄必军S黄文林,(1.华南肿瘤学国家重点实验室〃中山大学肿瘤防治中心,广东广州510060;2.成都军区总医院,普外科,四川成都610083)摘要目的】构建表达人内皮抑素的小环DNA载体与普通质粒,并观察其在真核细胞中的表达。【方法】从pedNA3.l(+)中扩增Pcmv和BGHpolyA片段,定向克隆于pSP72质粒中,构建成pSP72-Pcmv-BCHpolyA0将从pSP72-hEndo-sUtin-IRES-ECFP质粒中■切得到的hEndostatin-IRES-EGFP分别克隆到pSP72-Pcmv-BGHpolyA和pcDNA3.1(+),构建成pSP72-Pcmv-hEnd(»iatin-IRES-EGFP-BGHpolyA(pSP72-hES)和pcDNA3.1-hEnd(»tetin-IRES-EGFP(pcDNA-hES)o对质粒PSP72-hES和pvC31分别做双靜切,体外连接,构建成fxp-hESo艸-hES转化TOP10细菌后,通过介导分子内亶组,降解细菌骨架,荻取只含目的基因表达盒的小环DNA载体mc-hESo将mc-hES,p<p-hESspcDNA-hES分别转染CNE2细胞48h后,通过RT-PCR和Westernblot观索其表达。[结果】构建的p半・hES、mc-hES、pcDNA-hES序列正确,转染CNE2细胞后.3种质粒均有人内皮抑素蛋白的表达。[结论】成功构建了真核表达载体mc-hES.pcDNA-hES,p<p-hES,经转染细胞后在mRNA和蛊白水平证实有hEndosUtin的表达,且小环组明显高于其他两组。在相同情况下•小环载体的表达强度优于传统的质粒载体。关■词:小环DNA载体;内皮抑索}增强的绿色荧光蛋白;非病毎载体;质粒:R73;Q81文Itt标识码:A文章编码:1672-3554(2006)3S-0017-04第27卷第3S期2006年6月Vol.27No.3SJun.2006抗肿瘤血管生成治疗成为一种新的肿瘤治疗策略。内皮抑X(endostatin)被认为是目前最具潜力的抗血管生成物之一,具有显著抑制内皮细胞生长和抗血管生成的作用。国内外许多学者采用腺病毒载体,逆转录病毒载体,腺病毒相关病毒载体携带内皮抑素进行基因治疗,内皮抑累对多种实体瘤的生长和转移都能产生抑制作用卩“。我们构建一种新型的非病毒载体-小环DNA载体mc-hES,分析其和p<p-hES、pcDNA-hES在真核细胞中的表达差异,为小环DNA载体作为新的基因治疗的载体提供实验依据。1材料和方法1.1实验材料p<pc31(美国斯坦福大学陈之英教授惠赠),2刃2pcDNA3.1(+)均由本室保存。质粒纯化、凝胶回收试剂盒、T4连接试剂盒为0MEGABIO-TECK公司产品。实验所用的限制性内切酶BamHI、Xhol、XbaI、SacI、EcoRI、BgiII、Sall、NheI、Spe\,购自PROMEGA公司。大肠杆菌ToplO为北京天为时代公司产品。CNE2(人鼻咽癌)细胞为本室保存。Trizol和逆转录RT试剂盒为Promega公司产品。hEndostatin单克隆抗体(sc—32720)为SantaCruzBiotechnology公司产品。1.2Pcmv和BGHpolyA的扩增从pcDNA3.1(+)上通过PCR法分别获得Pcmv和BGHpolyA片段。Pcmv上游引物:5'ccggaattcgctagccgcgttgacattgattattgaetag3'含EcoRI、NheI酶切位点,下游引物:5'cgcggatccagagetetgettatatagacctecc3'含BamHI酶切位点(扩增长度615bp)oPCR反应条件为94X5min,941min58X1min72X.lmin共30个循环,72*€10min,4弋终止反应。BGHpolyA上游引物:5'gcctetagagtc-gacactgtgeeltelagttgccagccat3'含Xbal、Sal\酶切位点,下游引物:5'atactcgaggeeatagagcccaccgcateeccag3r,含Xho\m切位点(扩增长度251bp)oPCR反应条件:94X.5min,941min53弋1min721min共30个循环,72X.10min,4弋终止反应。13pSP72-Pcmv-BGHpolyA■组质粒的构建将纯化的经PCR扩增的Pcmv片段和pSP72分别用EcoRI+BamHI进行双酶切,用胶回收试剂盒回收纯化,再用T4DNA连接酶连接,转化人受体菌ToplO,筛选阳性克隆,进行小量质粒抽提获得pSP72-Pcmvo同样的方法将BGHpolyA克隆到pSP72-Pcmv中,将获得的pSP72-Pcmv-BGHpolyA重组质粒进行酶切及测序鉴定。1.4真核表达载休p<p-hES和pcDNA-hES■组质粒的构建将pSP72-Pcmv-BGHpolyA和pSP72-hEndostalin-IRES-EGFP分别用BamH]、SalI进行双酶切,体外连接,构建成pSP72-hESo再将pSP72-hES用Nhel、XhoI进行双酶切,将p<pc31进行"e\、XhoI双酶切,体外连接,构建成p<p-hES,进行酶切及测序鉴定。...

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