紫苏叶总黄酮提取物对过氧化氢所致人肾小管上皮细胞HK―2的氧化摘要：目的：探讨紫苏叶总黄酮（PLFE）对过氧化氢（H2O2）所致人肾小管上皮细胞氧化损伤的保护作用。方法：将HK-2细胞与H2O2和不同浓度的PLFE（10，25，50，100μg/ml）共培养24h，用MTF法观察PLFE对H2O2致损伤HK-2细胞活性的影响；硫代巴比妥酸法（TBARS）测定细胞内脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量，检测细胞内源性过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-px）的含量，观察分析PLFE对H2O2致损伤HK-2细胞的保护作用。结果：H2O2（损伤组）对HK-2细胞有明显的细胞毒性，PLFECF对H2O2所致HK-2细胞毒性损伤有保护作用。PLFE组细胞生存率与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。PLFE组对H2O2所致HK-2细胞的CAT、SOD和GSH-px的酶活性高于损伤组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：紫苏叶黄酮提取物对H2O2导致的HK-2细胞氧化损伤具有保护作用。关键词：紫苏叶总黄酮；肾小管上皮细胞；抗氧化物酶：R692.6文献标志码：A：1008-2409（2016）03-0014-04慢性肾脏疾患是一类严重威胁人类健康的疾病，其发病率呈逐年升高趋势，并伴有预后不良和较高的死亡率。体内过量蓄积的超氧化物离子、羟自由基和过氧亚硝基阴离子等活性氧（ROS）是细胞线粒体进行有氧呼吸产能量过程中，耗氧所生产的一类副产物。同时也是急性肾功能衰竭、梗阻性肾病、慢性肾衰竭所致的肾小球损害等肾病发病过程中的关键因素。细胞内源性过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-px）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）和一些低分子量抗氧化剂如谷胱甘肽（GSH）、维生素C和维生素E以及摄取具有抗氧化能力的食物都能有效地清除体内蓄积的ROS，并降低ROS蓄积所引起肾细胞损伤。紫苏叶总黄酮提取物对H2O2所致人肾上皮HK-2细胞的氧化应激损伤影响还未见报道。本研究旨在探讨紫苏叶总黄酮对H2O2致损的HK-2细胞免受氧化保护损伤的能力，并探究其作用的机制。1材料与方法1.1试剂四甲基偶氮唑蓝（Mrrr）、过氧化氢（H2O2），均购置于美国Sigma公司。DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素溶液和0.05%胰蛋白酶液，购自美国GrandIsland生物公司。紫苏叶总黄酮提取物（PLFE），实验室自备（20mg/ml）。1.2方法1.2.1细胞培养HK-2人肾近曲小管上皮细胞购自上海钰博生物科技有限公司。细胞置于37℃、5%CO2的环境下，用含有10%胎牛血清和1%青霉一链霉素的DMEM细胞培养基在Thermo3110型二氧化碳细胞培养培养箱（FormaScientific.Inc.Marietta，OH，USA）进行湿化培养。1.2.2细胞处理与生存率分析HK-2细胞按1×104个/孔接种于96孔细胞培养板中，以不同浓度的紫苏总黄酮提取物PLFE（10，25，50，100μg/ml）和200μM的H2O2共同培养24h。弃培养基并加入终浓度为0.5mg/ml的MTT溶液100μl继续培养细胞4h。待培养结束后，弃上清液，每孔加DMSO（100μl）避光振荡30min。用Bio-Rad680型酶标仪（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）在波长为490nm条件下的测定样品吸光度。1.2.3细胞内脂质过氧化物量的测定以冰磷酸盐缓冲盐水（PBs）冲洗细胞后，加入2.8%三氯乙酸溶液，在40V的电压下超声裂解细胞3次，每次间隔10s。然后在细胞裂解液中加入1ml的0.67%硫代巴比妥酸溶液和25%三氯乙酸混合溶液后在95℃下加热30min。将加热后的反应液在4℃，3000rpm条件下离心10min。因硫代巴比妥酸与脂质过氧化产物发生反应，可以生成红色络合物丙二醛（MDA）。岛津UV-2401PC型紫外分光光度仪（Kyoto，Japan）532nm处测定OD值。细胞蛋白含量以ThermoSdentificPierceBCA蛋白检测试剂盒（Pierce，Rockford，IL，USA）定量。1.2.4细胞内抗氧化酶活力与谷胱甘肽水平分析37℃条件下，将HK-2细胞与PLFE和200μM的H2O2置于10cm的细胞培养皿中共同培养24h。冷PBS（0.1mol/L，pH7.4）冲洗收集的细胞2次后，刮取细胞，置4℃并在3000rpm条件下离心10min。在离心收集到的细胞中加入300μl冷细胞裂解液（含1mMEDTA），混匀，在4℃和12000rpm条件下离心10min。细胞蛋白含量以ThermoScientificPierceBCA蛋白检测试剂盒测定。细胞内CAT、SOD和GSH-px水平测定采用商业检...