结核分枝杆菌16kD-38kD-19kD融合蛋白的构建、表达及纯化赵爽1马晓蕾2张新慧2常琳2席志慧2（通讯作者）（1沈阳市第四人民医院儿科辽宁沈阳110031）（2沈阳万类生物科技有限公司辽宁沈阳110000）【摘要】目的：构建结核分枝杆菌（MTB）16kD-38kD-19kD融合基因重组质粒，并对融合蛋白进行表达及纯化。方法：利用PCR方法分别扩增16kD、38kD及19kD基因，经过双酶切依次与pET28a载体连接，构建pET28a-16kD-38kD-19kD融合基因重组质粒，转化至大肠杆菌表达株BL21中，经IPTG诱导获得目标蛋白，并进行镍柱纯化。结果：经过酶切及测序鉴定证实pET28a-16kD-38kD-19kD重组质粒构建正确，并经原核表达及纯化获得融合蛋白。结论：成功构建并表达纯化16kD-38kD-19kD融合蛋白，为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。【关键词】结核分枝杆菌；16kD蛋白；38kD蛋白；19kD蛋白；融合蛋白【中图分类号】R394【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2015）10-0221-03Construction,ExpressionandPurificationofRecombinantFusionProteins16kD-38kD-19kDofMycobacteriumtuberculosis【Abstract】ObjectiveToconstructtherecombinantplasmidofMycobacteriumtuberculosis（MTB）16kD-38kD-19kDfusiongene,andtoexpressandpurifythefusionprotein.Methods:16kD,38kDand19kDproteingeneswereamplifiedfromthegenomeofMycobacteriumtuberculosisbyPCR,andinsertedintothepET28avectorafterrestrictionenzymedigestion.PET28a-16kD-38kD-19kDrecombinantplasmidwasconstructedandtransformedintoE.coliBL21,andthetargetproteinwasinducedbyIPTG,thenthepurifiedproteinwasobtainedbyNi-NTAaffinitychromatography.ResultsPET28a-16kD-38kD-19kDrecombinantplasmidwasconfirmedbyrestrictionenzymedigestionandsequencing,andthefusionproteinwasobtainedbyprokaryoticexpressionandpurification.ConclusionConstruction,expressiona---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---ndpurificationof16kD-38kD-19kDfusionprotein,whichlaysthefoundationforthedevelopmentofthetuberculosisspecificantigen.【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis;16kDprotein,38kDprotein;19kDprotein;Fusionprotein结核病（TB）是危害人类健康的一种重要传染病，发病率及病死率居高不下。在我国结核病人数量位居世界第二，仅次于印度,对公共卫生体系造成沉重负担。准确、快速的对结核分枝杆菌感染进行诊断是肺结核防治的重要一环，0前结核病诊断仍主要依赖于临床观察、痰涂片检测以及细菌培养，但是涂片阳性率低而iL培养耗时过长影响检测的效率，因此，近年来血清免疫学诊断以简单、快速、经济等优点受到重点关注。近年来人们对MTB培养液进行较多研究，并分离出多种蛋白，如Ag85、16kD、38kD、19kD、CFP10等，但是单一抗原的血清学诊断敏感度有限，难以区分患结核病以及结核菌感染人群［1-3］。本研究分别扩增了16kD、38kD、19kD基因片段并依次构建于原核表达载体形成融合基因，并在大肠杆菌中成功表达及鉴定，为结核病的临床诊断提供一个候选抗原。1.材料及方法1.1主要材料及试剂结核分枝杆菌标准株H37RV菌体来源于沈阳市胸科医院，原核表达质粒pET28a购自Novagen,TaqDNA聚合酶、pGM-T连接试剂盒、DNA快速纯化试剂盒、基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒、DNAMarker、蛋白Marker购自天根生化（北京），核酸内切酶Ndel、BamHI、EcoRI、Hindlll均购自Promega（美国）。引物委托上海生工合成。1.2引物设计与合成根据GenBank中发表的16kD、38kD以及19kD基因序列设计特异性引物如下：16kD上游：5’-GGAAGGCATATGAACAATCTCGCATTGTGGTCGC-3’（含有Ndel位点及起始密码子）；16kD下游：5’-TTATTAGGATCCTCCGCCACCCTTCGTGATGGCGATG-3’（含冇BamHI---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---位点及Linker）；38kD上游5’-GCTGACGGATCCGTGAAAATTCGTTTGCATAC-3’（含有BamHI位点•’）38kD下游：5’-GTATTAGAATTCGCTGGAAATCGTCG...