类风湿关节炎大鼠滑膜细胞凋亡基因调控的实验研究周文旭谭湘淑佘君摘要：目的觀察甲氨蝶呤（MTX）对类风湿关节炎（RA）大鼠滑膜细胞凋亡及细胞凋亡调控基因的影响，探讨MTX的作用机制。方法选择SPF级雌性健康SD大鼠40只，每只大鼠尾根部皮下多点注射Ⅱ型胶原蛋白0.2mg，造模后l0d将动物随机分为假模型组、模型组，高（30mg/kg）、中（3mg/kg）、低（0.3mg/kg）给药组，各8只。给药组每组按10ml/kgMTX灌胃，假模型组、模型组给予等量生理盐水灌胃。分离培养大鼠膝关节滑膜组织，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，WB技术检测Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表达情况。结果高、中、低剂量给药组抑制大鼠足肿胀的作用均优于模型组（P<0.05），且呈剂量依赖性;各组均能不同程度诱导RA滑膜细胞凋亡，高剂量给药组与模型组及假模型组比较，诱导RA滑膜细胞凋亡更明显（P<0.05）;高剂量给药组Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表达量与模型组比较明显上调，Bc1-2蛋白表达量下降（P关键词：关节炎，类风湿;甲氨蝶呤;细胞凋亡;滑膜;大鼠;Bcl-2;Caspase-3：R593.22：ADOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.021：1006-1959（2020）05-0071-03Abstract：ObjectiveToobservetheeffectsofmethotrexate（MTX）ontheapoptosisofsynovialcellsandapoptosis-regulatinggenesinratswithrheumatoidarthritis（RA），andtoexplorethemechanismofactionofMTX.Methods40SPFfemalehealthySDratswereselected.Eachratwasinjectedsubcutaneouslywith0.2mgoftypeⅡcollagenatthesubcutaneouspoint.Onthe10thdaftermodeling，theanimalswererandomlydividedintoashammodelgroup，amodelgroup，ahigh（30mg/kg），amedium（3mg/kg），andalow（0.3mg/kg）administrationgroup.Eachgroupconsistedof8rats.Eachdosegroupwasadministratedwith10ml/kgMTX.Theshammodelgroupandmodelgroupweregiventhesameamountofnormalsaline.Thekneesynovialtissueofratswasisolatedandcultured，andtheapoptosisratewasdetectedbyflowcytometry，andtheexpressionofCaspase-3，Caspase-9，Bax，Bcl-2wasdetectedbyWBtechnology.ResultsThehigh，mediumandlowdosegroupswerebetterthanthemodelgroupininhibitingtheswellingoftherats'feet，thedifferencewasstatisticallysignificant（PKeywords：Arthritis，rheumatoid;Methotrexate;Apoptosis;Synovialmembrane;Rat;Bcl-2;Caspase-3类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种临床常见的以侵犯关节滑膜、软骨及骨为主的自身免疫病，其发病机制复杂，病变过程涉及多种细胞和细胞因子，位于关节滑膜内层的成纤维样滑膜细胞（fibroblast-likesynoviocytes，FLS）在RA病变中异常活化，是介导关节局部炎症的关键细胞之一。研究表明[1]，RA的关节软骨和骨组织损害，与滑膜细胞的过度增生活化与凋亡不足密切相关。因此，抑制炎性滑膜组织增生及诱导滑膜组织中各种细胞凋亡是类风湿性关节炎治疗的靶点[2，3]。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是传统的改善病情抗风湿药（DMARDs），近20多年来已成为RA临床治疗的基石用药（Anchordrug）[4]，但其治疗RA的作用机制尚不明确。本研究采用CIA模型，观察MTX对大鼠整体疗效及对滑膜组织中Bcl-2、Bax、caspase-3、9蛋白的表达影响，探讨MTX治疗RA的作用机制，以期为寻找新的抗RA药物提供实验依据。1材料与方法1.1实验动物本实验方案已通过西安交通大学医学院动物实验伦理审查委员会审查同意，审批许可号为XJMU2018032。SPF级雌性健康SD大鼠40只，体重50～100g，体重（120±20g），鼠龄4～5周，中国医学科学院生物制品研究所提供。实验开始前1周进行适应性饲养，保持室内22℃，自由摄食。1.2药品与试剂酸可溶性Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）与弗氏不完全佐剂为Sigma公司产品，MTX片（通化茂祥制药有限公司，国药准字H22022674，规格：2.5mg×100片），Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體及辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠IgG购自碧云天生物技术有限公司。Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自美国Thermo公司;荧光定量试剂购自北京康为世...