荧光PCR检测麻风杆菌DNA与涂片抗酸染色结果的对照分析刘少刚1郑华牛2林肠2蔡銮端2郑睦畅2(1汕头大学医学院广东汕头515031)(2广东汕头市澄海区慢性病防治站广东汕头515800)【摘要】目的探讨荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA的拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度的相关性。方法对5例现症麻风患者不同时期和16例多菌型治愈者的44份皮肤组织液样木，同时进行荧光定量PCR检测和做涂片抗酸染色镜检，按荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA结果的拷贝数和对应涂片抗酸染色镜检结果分为阴性卜)、1+、2+、3+、4+、5+、6+进行统计分析。结果32份皮肤组织液涂片阴性样木中,4份样木荧光定量PCR检测阳性，麻风杆菌DNA拷贝数多为103数量级;12份涂片阳性样木中，对应荧光定量PCR检测全部阳性，麻风杆菌DNA拷贝数多为104〜105数量级，和涂片阳性程度基木呈正相关，荧光PCR检测阳性率比涂片抗酸染色高，但经统计学分析差异无显著性，(P&gt；0.05)o结论荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度有较好的相关性，可以作为麻风病临床诊断和治疗的实验方法。【关键词】麻风分枝杆菌荧光定量PCR抗酸染色【中图分类号】R394【文献标识码】A【文章编号］2095-1752(2012)13-0015-02随着基因扩增技术的成熟和推广，荧光定量多聚酶链反应(FQ-PCR)检测病原体被广泛应用于医学各科，为了解荧光定量PCR检测麻风杆菌的情况，比较其拷贝数与传统常规的涂片抗酸染色镜检结果程度的相关性。我们于2010年3月至2012年5月，对汕头市澄海区的5例现症麻风病人的不同时期，以及16位已治愈的多菌型麻风治愈者共44份皮肤组织液样木同时进行荧光定量PCR检测和做涂片抗酸染色镜检,现报告如下。1资料和方法1.1硏究标木：44份皮肤组织液样木来源于5例麻风现症病人(4例为多菌型，1例为少菌型)的治疗前、治疗半年、治疗1年不同时期和16位多菌型麻风治愈者，取活动性皮损皮损组织液，或眶上、额部、下颌和耳垂至少2个部位的皮肤组织液。1.2标本的采集和处理：常规消毒皮肤，检查吋戴消毒手套，用左手拇、食两指将患者皮肤捏紧提起，使局部皮肤变白，左手指不要松，然后右手持脱刀切开一个5毫米长，3毫米深的切口，以刀刃刮取组织液，粘于灭菌拭子放入密闭的离心管，冷藏做PCR检测麻风菌DNA用，同吋刮取组织液涂在载玻片上，固定做抗酸染色用。1.3荧光PCR检测麻风杆菌DNA：(1)仪器设备与拭剂:全自动基因扩增仪采用中山大学达安公司的DA7600,麻风杆菌核酸荧光PCR检测试剂盒是美国BioXL公司提供。(2)DNA的提取：按试剂盒的说明，加生理盐水lml,充分混匀，lOOOOrpm离心5分钟，弃上清。加50&mu;l核酸提取液B,充分混匀。100°C处理10分钟，lOOOOrpm离心5分钟，取上清液4&mu;l做PCR反应。(3)PCR扩增:每个反应管加入26&mu;l试齐IJCML-PCRMIX24&mu;l+Taq酶系2&mu;l),加入处理后DNA样本或阳性定量标准品梯度(使用前用阴性质控品将ML■阳性标准品(l&times;107COPIES/ml)梯度希释10倍、100倍、1000倍，记为l&times;106COPIES/ml,l&times;105COPIES/ml,l&times;104COPIES/ml)和阴性质控品4&mu;l,10000rpm30秒。循环条件：93°C&rarr;2分钟，后93°C5秒&rarr;56°C45秒，共40个循环。(4)结果分析判定：保存数据，调节标准曲线至最佳，仪器自动分析计算出未知标本数值。1.4涂片抗酸染色镜检：(1)染色：初染：滴加石碳酸复红溶液，小心加热5分钟。脱色：3%盐酸洒精脫色30秒至1分钟。复染：用碱性美兰溶液复染1分钟。(2)油镜观察：麻风杆菌呈红色，常聚集成堆，背景及非抗酸性细菌呈兰色。(3)报告：镜检按以下细菌密度计数。阴性(一)：在200个视野中未查到抗酸杆菌；(1+)：100个视野中有1〜10个菌；(2+)：每10个视野中有1〜10个菌；(3+)：平均每个视野中有1〜10个菌；(4+)：平均每个视野中有10〜100个菌；(5+)：平均每个视野有100〜1000个菌；(6+)：每个视野中超过1000个菌或大量菌团。1・5统计学分析：计数资料用&chi;2检验进行通计分析,以P<0・05为差异显著。抗酸染色镜检结果程度与PCR检测麻风杆菌DNA拷贝数比较按每个程度对应的DNA拷贝数数量级进行分类分析。2结果2.1两种检验方法阳性率的比较44份标本荧光PCR检测麻风杆菌DNA与涂片抗酸染色阳...