低分子肝素对大鼠脑局灶性缺血再灌注后Bcl2，Bax表达的影响及保护作用作者：高素玲，王大力，常莉莎，赵晓晶，张丽【摘要】目的：观察低分子肝素对大鼠脑缺血再灌注后不同时间点Bcl2,Bax表达的影响及保护作用.方法：①选用雄性SD大鼠54只，体质量280～330g.应用随机数字表法将大鼠分为3组：假手术组、缺血再灌注组和低分子肝素组，每组18只.②应用免疫组化方法测定海马CA1区神经元细胞凋亡基因Bcl2,Bax表达情况.③采用两样本均数的t检验对两组间数据进行分析.结果：大鼠54只均进入结果分析，缺血再灌注组大鼠脑缺血再灌注6，12，24h时Bcl2蛋白在神经元内表达的阳性细胞数较低分子肝素组同一时间点明显减少，两组比较具有显著的统计学意义（P《0.05）.缺血再灌注组大鼠脑缺血再灌注6，12，24h时Bax蛋白表达的阳性细胞数较低分子肝素组同一时间点明显增加，两组比较具有显著的统计学意义（P《0.05）.结论：脑缺血再灌注损伤随再灌注时间延长而加重，低分子肝素可能通过减少Bax蛋白的表达，上调Bcl2蛋白表达，从而减轻神经元的损伤及凋亡，起到脑保护作用.【关键词】大鼠---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---0引言大脑中动脉是缺血性脑血管病的易患部位，在脑梗死患者中大脑中动脉主干分布区梗死占82.2％［1］，我们通过制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型，观察低分子肝素对大鼠脑缺血再灌注后不同时间点Bcl2,Bax表达的影响及保护作用.1材料和方法1.1材料雄性SD大鼠54只，清洁级，3～4mo龄，体质量280～330g［华北煤炭医学院动物实验中心，许可证号scxk（冀）20050001］.动物饲养环境自然光照，环境安静，温度适中.应用随机数字表法将大鼠分为3组：假手术组、缺血再灌注组、低分子肝素组，每组18只.低分子肝素(速避凝，杭州赛诺菲圣得拉堡民生制药有限公司)；Bcl2,Bax试剂盒、PV6001(兔二步法)、DAB显色剂、PBS试剂盒、APES粘片剂、EDTA修复液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；苏木素、伊红、多聚甲醛和无水乙醇（本院病理教研室）；CMIAS真彩医学图像分析系统(北京航空航天大学研制)；Olympus摄像显微镜(日本)；KPJ1烤片机(天津)；Leica石蜡切片机(德国)；LY3型切片机(上海)；微量液体加样器(上海)；数码温控微波炉(天津)；手术操作台(自制)；60℃～100℃水育箱(上海).---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---1.2方法1.2.1模型制作采用改良Longa等［2］法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型.造模成功评估标准：①提尾时大鼠左前肢内收屈曲；②爬行时向左侧倾倒或按逆时针方向转圈;③右眼Horner征.1.2.2分组干预假手术组只游离右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉.缺血再灌注组和低分子肝素组均建立大鼠右侧大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型.缺血2h后分别腹腔注射生理盐水1mL和皮下注射低分子肝素（200U/kg，用生理盐水稀释至1mL），两组均于缺血2.5h后开始再灌注6，12，24h，每个时间点取6只进行观察.1.2.3标本采集与检测将大鼠在各个时间点经腹腔注射100mL/L水合氯醛（0.003～0.004mL/g）再次麻醉，固定四肢及头部，迅速打开胸腔暴露心脏，剥离心包，将灌注针头自左心室插入到升主动脉，固定针头，剪开右心耳，依次灌注生理盐水100mL，40g/L多聚甲醛(0.01mol/LPBS，pH7.4)500mL，待肝脏变白变硬后，将大鼠断头取脑，去除嗅球、脑干、小脑，以视交叉和其后4mm处两点冠状切片，取脑组织块，置4℃，40g/L多聚甲醛24h，常规脱水，包埋制成蜡块.石蜡切片厚度5μm，40℃水浴展开，用经粘片---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---剂处理过的载玻片捞片，置于60℃烤箱中烘烤1h，再行HE染色和免疫组织化学染色.石蜡切片脱蜡至蒸馏水，EDTA微波热修复，维持煮沸10min，冷却至室温，3mL/LH2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶10min，用PBS洗3次，每次洗3min，正常山羊血清封闭内源性抗原20min，滴加适当稀释（1∶100）的一抗，40℃过夜，PBS洗3次，每次洗3min，滴加抗兔HRP多聚体，在37℃放置40min，DAB显色镜检控...