大肠埃希菌临床分离菌株喳诺酮类抗生素耐药机制探究［摘要］目的探讨我院临床分离的大肠埃希菌株耐药基因的分布及其在耐药中的作用机制。方法选择我院临床分离的大肠埃希菌菌株，采用纸片扩散法进行喳诺酮类药物药敏试验，筛选耐药菌株并测定环丙沙星MIC,对喳诺酮耐药菌株进行qnrA、qnrB.aac~(6')Tb-cr、GyrA及ParC检测，并进行基因扩增测序。结果84株临床分离的大肠埃希菌菌株中有24株对喳诺酮类药物耐药，耐药率为2&4%。其中对2种药物耐药4株，对3种药物耐药6株，对5种药物耐药14株。耐药菌株MIC值为对照菌株148〜596倍，24株耐药菌中检出qnrA质粒基因12株、qnrB质粒基因4株、88(3-(6?)-Ib-cr基因4株、GyrA基因喳诺酮决定区突变11株、ParC基因决定区突变4株。结论我院存在大肠埃希菌喳诺酮耐药菌株，且耐药菌株耐药机制复杂，耐药基因的产生及酶类耐药突变是主要原因，临床要加强对耐药菌株的检测。［关键词］大肠埃希菌；喳诺酮；抗生素；耐药基因［中图分类号］R446.5［文献标识码］B［文章编号］1673-9701(2013)10-0080-03大肠杆菌是临床常见的致病菌，大肠埃希菌是其中最常见的菌属，伴随近年来抗菌药物的临床应用及抗生素的不断发展，大肠埃希菌的耐药菌株不断出现，且耐药性不断提高,耐药机制日趋复杂，如细菌酶类耐药突变、耐药基因的突变表达等，近年来质粒耐药机制相关的质粒基因如qnrA、qnrB等成为研究热点[1,2],质粒具有可转移性，其不仅能够导致耐药菌株对抗生药的耐药，而且能够引起耐药性在不同菌株之间的传递，导致菌株广泛耐药，严重影响临床治疗效果,目前临床已经分离出多个耐药基因，本研究就qnrA.qnrB.aac-（6，）-Ib-c等耐药基因在耐药性大肠埃希菌的表达及其作用机制进行研究，为大肠埃希菌耐药菌株的检测提供参考。1材料与方法1.1菌株来源选择我院2010年1月〜2012年6月临床分离的非重复84株大肠埃希菌菌株，分离菌株均经VITEK2-compact微生物鉴定系统鉴定到种，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922菌株，结合实验菌株为大肠埃希菌J53AzR菌株。所有菌株均深低温保存，临用前复苏。1.2主要仪器及试剂环丙沙星（CIP）药敏纸片、左氧氟沙星（LVX）药敏纸片、诺氟沙星药敏纸片（NFX）、司帕沙星（SPX）药敏纸片、氧氟沙星（0FX）药敏纸片购自武汉博士德生物试剂公司，平板琼脂购自浙江碧云天生物试剂公司，肉汤培养基购自南京建成生物工程研究所，Taq、dNTPs、DNAMarkerlll及DNA100bpLadder购自美国Sigma公司，TanonEPS-100型电泳仪购自北京原平皓生物技术有限公司，VITEK2-coinpact微生物鉴定系统购自法国梅里埃公司，梯度PCR仪购自德国Eppendorf公司，UVP凝胶成像系统购自美国Sigma公司。1.3药敏实验及菌株筛选菌株耐药性检测采用纸片扩散法进行药敏实验，检测5种喳诺酮类药物(环丙沙星药、左氧氟沙星、诺氟沙星、司帕沙星片、氧氟沙星)，药敏试验结果参照2009年版CLSIM100-S19规定执行，选择耐药菌株培养进行实验。1.4MIC值测定抗生素最低抗菌药物浓度测定采用微量肉汤稀释法测定，测定药物选择环丙沙星，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922菌株。1.5PCR反应采用煮沸法制备模板，印务设计参照GenBank基因图谱设计引物，引物序列如下：qnrA上游引物：5'-ATTTCT-CACGCCAGGATTTG-3，，下游引物:5，-GATCGGCAAAGGTTAG-GTCA-3',扩增片段730bp；qnrB±游引物：5’-GATCGTGAAAGCCAGAAAGG-3\下游引物:5，-ACGATGCCTGGTAGTTGTCC-3\扩增片段469bp；aac-(6‘)-Ib-cr±游引物:5，-GCTCACGCCAGGATT-3，，下游引物：5，-GATGC-CTGGTAGTTGTCC-3',扩增产物214bp；gyrA上游引物：5’-TGGGCAATGACTGGAACA-3\下游引物：5’-GGTCGGCCATCAGTTCAT-3\扩增产物469bp；parC上游引物：5’-GCGAACGATTTCGGATCGTC-3',下游引物：5’-CTGAATGCCAGCGCCAAATT-3，，扩增产物423bpoqnrA、qnrB及aac-（6‘）-Ib-cr扩增条件95°C变性，55°C退火，72°C延伸，45个循环，gyrA及parC扩增条件941变性、551退火，72。（2延伸，45个循环，PCR反应完毕后，反应产物进行凝胶琼脂电泳，割取目的条带，gyrA及parC扩增产物进行测序，测序过程由上海生工生物工程技术服务有限公司完O2结果2.1药敏实验及菌株筛选结果84...