白藜芦醇荧光衍生物的合成及在肝癌HepG2细胞中的应用曹轩唐国涛杨慧龄朱炳阳喻翠云(南平大学药学与生命科学学院药学系湖南衡阳421001)【摘要】目的合成白藜芦醇的荧光衍生物并将其运用于肝癌HepG2细胞方法：以丹磺酰氯和白藜芦醇反应合成荧光衍牛.物，激光共聚焦观察其在肝癌HepG2细胞的作用结果荧光衍生物荧光强度好、稳定，能与细胞膜上的小凹蛋白CAVI特异性结合成像。结论该荧光衍生物可用于细胞成像，并可能对白藜芦醇的具体转运机制与转运过程提供帮助。【关键词】白藜芦醇荧光衍生物激光共聚焦【】R961【文献标识码】A【】2095-1752(2012)11-0068-021前言白藜芦醇(resventrol)，是一种含有芪类结构非黄酮类多酚化合物，自1940年该成分被发现以来，一直受到医药界的重视，迄今为止的研究表明，白藜芦醇只有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化、抗菌、抗炎等作用［1-6］,異有很大的药用价值和市场前景。虽然有诸多学者对其药理作用进行了详细研究，但是具体的作用途径及转运途径仍不明确。运用荧光检测是研究药物作用与细胞转运的一个有效的手段，目前已经广泛用于环境科学、药理学、药物化学以及生物化学等领域［7,8］。通过荧光标记不但能对目标物进行定性和定量检测，同时在细胞领域可以实现对细胞中特异位点进行标记而进行定位，从而了解其作用机制与转运过程［9］。木文合成了白藜芦醇的荧光衍生物,并将其应用于肝癌HepG2细胞,发现其能有效的与HepG2细胞上的小凹蛋白CAV1特异性结合，荧光强度好，稳定，可为进一步研究白藜芦醇及其衍生物的细胞内转运和作用机制提供可靠和有效的方法。2实验部分2.1材料与方法---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---2.1.1仪器蔡司LSM510激光共聚焦显微镜，日立F4600荧光分光光度计，水浴摇床，化合物鉴定1HNMR、MS、元素分析由中山人学化学化工学院分析测试中心提供。2.1.2试剂HepG2细胞株购自中科院上海生命科学研究院，Cy3-rabbitantihumanCAV1antibody购自SantaCruze生物科技(USA)，白藜芦醇、丹磺醜氯购自Sigma公司，其余试剂为市售分析纯试剂，实验用水为2次蒸馏水。2.1.3荧光衍生物1的合成228mg(1.0mmol)白藜芦醇溶于10ml丙酮，加入lgKCO3,N保护下冰浴lOmin,逐滴加入10ml含270mg(1.0mmol)的丹磺(2)酰氯丙酮(2)溶液，滴毕升至室温搅拌20分钟，加热至冋流2h。冷却后过滤，蒸除有机溶剂，得到淡黄色粉末。柱层析氯仿-甲醇溶液(30:1)分离纯化结晶后得到黄绿色晶体。1HNMR(400MHz,CDCI3)：delta;8.31(d,lH),delta;8.08(d,lH),delta;7.84(d2H),delta;7.65(d,2H),delta;7.39(t,lH),delta;7.01(d,lH),delta;6.92(d,lH),delta;6.85(d,lH),delta;6.80(d,2H),delta;6.37(s,2H),delta;6.14(s,lH),delta;5.35(s,2H),delta;3.06(s,6H);m/z:461.13(100.0%)；ElementalAnalysis(%):C,67.66;H,5.02;N,3.03;0,17.33;S,6.95Scheme1化合物1的合成Scheme1Synthesisof12.1.4HepG2细胞的培养按文献［10］方法，将冻存细胞40°C水浴摇床60r/min慢摇至苏溶化，然后转入37°C水浴箱，慢摇恒温2〜3min复苏，800r/min离心5min,去上清，加入10ml含15%胎牛血清DMEM培养基混匀后加入细胞培养板每孔lml，5%C0温箱37°C培养。待细胞贴壁(,)并长满后，弃去旧的培养(,)基，再用己经高压⑵火菌过的pH7.2的PBS洗2次，加入1ml己经配制好的0.25%胰蛋白酶---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除----0.02%EDTAlmin,吹打使细胞分散，弃上清夜，再加入完全培养基吹匀，分瓶。放入5%的CO2培养箱，37°C培养24h后取对数期细胞待用。2.1.51与HepG2细胞作用在细胞培养液中加入1的DMSO溶液至300mu;mol/L，DMSO含量0.1%,分别孵育lh，4h，8h，16h,以冷pH6.8的PBS洗涤2次，用于蔡司LSM510激光共聚焦显微镜观察。2.1.6荧光共定位研究将1染色lh后的细胞以甲醇-冰醋酸(3:1)溶液混合15min,37°C加入0.25%Triton+5%DMSO通透20min，随后加入5%的TBST溶液，37"C封闭2h加入Cy3-rabbitanti-humanCAV1antibody(1:200)孵育45分钟，以冷pH6.8的PBS洗涤2次，蔡司LSM510激光共聚焦显微镜观察。3结果与讨论3.1荧光探针的光谱行为...