酵母样真菌鉴定及应用赵立春(黑龙江省哈尔滨市香坊区结核病防治所化验室150036)【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672・5085(2010)32-0440-01近年来随着广谱抗牛素、免疫抑制剂广泛应用和机会致病菌的医院感染包括临床深部真菌感染增多，特别是肺结核病人或肺部疾病患者，因药物治疗时间长，在杀死致病菌的同时，也杀死正常菌群，造成人体内微牛态障碍，菌群失调，在肺结核等肺部疾患基础上继发支气管肺部酵母样菌感染，所以从肺部疾患病人中分离酵母样真菌，快速鉴定并及时治疗非常有意义。我国现在快速、准确鉴定酵母样真菌的方法很少，近年国外开发的手工和自动化微量鉴定系统己大大简化了传统鉴定程序，但难已在中小医疗机构推广应用，我们研制的微量鉴定系统，通过与传统鉴定方法及牛物梅里埃Api20c鉴定系统对比性评价，并经数家医疗单位临床应用，证明木系统具有可靠、快速、简便和价廉等优点，可推广为临床常规方法，报道如下：1材料与方法1.1菌株来源：主要来自香坊区结核病防治所，治疗一个月以上肺结核、脑膜炎、慢性支气管炎等患者，从痰中分离出2・3次同一种菌株。标准菌株为中国科学院微牛物研究所“真菌国家开放专业实验室质控菌株。1.2试剂：葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、密二糖、纤维二糖、肌醇、棉子糖、海藻糖、卫矛醇、草糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖醇、赤蘇醇、山梨醇、尿素、KNO3、KH2P4、NaHPO4和MgSo4>7H2O系分析纯。优质琼脂粉、玉米粉、酵母浸膏和吐温80。1.390mm培养皿或U形塑料凹孔盒、新华111号滤纸、打孔器等。1.4生物梅里埃公司生产的API——20C鉴定卡。1.5酵母菌编码鉴定手册：0.5麦氏单位，1麦氏单位、2麦氏单位比浊管。2微量鉴定系统制备2.1基础培训基：琼脂20g>酵母浸膏0・2g、MgSo4>7H2O0・5g、PH6.8PBS加至lOOOmlo加热溶解，分装后经8P、15分钟灭菌。存于4°C可用2个月。2.2玉米吐温琼脂：制成小安瓶备用。2.3生化基质制备：糖醇配方：糖或醇2.0g>B族维生索0.2mg>2%澳甲酚紫0.2ml,蒸憾水加至lOmL尿素配方：尿素5.0g、葡萄糖O.lg.B族维生素O.lmg,蒸徭水至lOmL硝酸盐配方：KNO32.0g、葡萄糖0.5g>B族维生素O.lmg,蒸憾水至lOmL阴性对照配方:不含糖、醇、尿素和硝酸盐,余皆相同。将6×6mm滤纸圆片浸入上述各基质液中，10分钟，取出置70°C烤干，经随机抽样无菌试验后，分装于小瓶中密封，・20°C可用一年以上。2.4沙保弱培养基按常规自配。3实验程序3.1基础菌悬液制备：排取沙保弱氏之新鲜培养菌落以生理盐水制成0.5麦氏单位的菌悬液。基础培养基经隔热煮沸溶解，冷却至50°C,与菌悬液等量混合，置于50°C水溶备用。3.2操作步骤：各种基质纸片、阴性对照纸片按顺序置于分格的无菌平皿底部或U形塑料盒之凹内。消毒试器吸取上述菌悬液，每种纸片上滴加3滴，接种针挑取少许培养菌穿刺接种于玉米粉吐温琼脂。置于温盒、30°C孵育。3.3结果读取和判断：绝人部分酵母样真菌在24-48小吋即可读取结果，个别种属需72小吋。碳源同化阳性:培养基呈黃色与对照相比呈+〜3+混浊；阴性呈紫色且不混浊。尿素水解阳性为红色；阴性为淡黄色不变。硝酸盐还原需以常规硝酸盐还原甲、乙两液依次加2滴，显红色为阳性；不显红色为阴性。玉米粉吐温球脂脂生长菌落用显微镜观察厚泡子、泡子及菌丝体。4评价方法4.1传统方法：包括形态学的质膜范子、孑包子、菌丝体及芽管形形成,糖醇同化，糖醇发酵（制成安瓶封装），尿素水解（安瓶封装），硝酸盐还原，氮源同化等。4.2标准菌株与传统鉴定方法.API20C鉴定止，微量鉴定系统鉴定比较。4.341株临床分离酵母菌用API20C鉴定卡与微量鉴定系统鉴定比较。4.498株临床分离醇母菌用传统法与微量鉴定系统鉴定比较。5结果5.16种标准酵母株用传统鉴定方法，API20C鉴定卡与微量鉴定系统三种方法鉴定符合率100%。5.2与API20C鉴定卡鉴定结果比较：对6种41株临床分离酵母菌用两种方法分别进行鉴定，两者的符合率为95.1%,两法结果不符的两株菌经传统方法鉴定和微量法重要鉴定是由于木糖、棉子糖、卫矛醇生化基质含量不均匀所致的鉴定错误。5.3临床应用评价:徽量鉴定系统与传统方法之间的鉴定符合率达98%,其中...