食品中金黄色葡萄球菌荧光定量PCR快速检测方法的建立【摘要】目的:利用荧光定量PCR检测技术,建立由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速检测方法.方法:以金黄色葡萄球菌的特异性DNA核酸片段作为靶序列,采用聚合酶链反应(PCR)结合Taqman技术,以哈尔滨市２０１３~２０１４年度食源性致病菌主动监测分离鉴定的菌株作为阳性菌,对其进行荧光检测.结果:本研究建立的反应体系对１８株金黄色葡萄球菌呈现出良好的扩增曲线,在５株相关细菌的检测中,除金黄色葡萄球菌结果为阳性外,其余菌株均为阴性.结论:该方法特异性强、灵敏度高,操作简便快速,适应于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒及食源性疾病的快速检测,具有较大的推广及应用价值.【关键词】金黄色葡萄球菌;快速检测;荧光定量PCRR１５５ADOI:１０．１０１６/j．issn．２０９５－８５７８．２０１５．０１．０１０EstablishmentofRealＧtimequantitativePCRMethodforDetectionofStaphylococcusaureusinfoodPanyuＧHui,liyu,caixiuzhi,wangyan,suntingyuan,sunhong,,xuyanxia(HeilongjiangProvince,HarbinCenterforDiseaseControlandPevention,Harbin,１５００５６China)Abstract:Objective:ToestablisharapidsensitiveandspecificdetectionmethodfordiarrheagenicdiseasecausedbystaphylococcusauＧreuswithRealＧtimequantitativePCR．Methods:AsstaphylococcusaureusspecificDNAfragmentasatargetnucleicacidsequence,usingthepolymerasechainreaction(PCR)withTaqmantechnology,detectedpositivestaphylococcusaureusstrainsisolatedfromthe２０１３—２０１４foodbornepathogensmonitoringofHarbinCity．Results:１８strainsofstaphylococcusaureuspresentedagoodamplificationcurve．Inadditiontostaphylococcusaureusstrainsappearedgoodamplificationcurve,theresultwaspositive,theotherfivestrainsallwerenegative．ConcluＧsion:Themethodisspecificity,highsensitivity,handilyandrapid,whichmighthaveadapteddiarrheagenicdiseasecausedbystaphylococＧcusaureusdevelopmentneedandhavegreatpromotionandapplicationvalueinpraticalwork．Keywords:Staphylococcusaureus;Rapiddetection;RealＧtimePCR金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一种普遍存在于自然界中的一种重要食源性致病菌之一.在我国,由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒约占细菌性食物中毒的２５％,而在美国、加拿大等国家,更是高达５０％[１－２].因此,食品一旦被金黄色葡萄球菌污染极易引起食源性疾病的暴发流行.金黄色葡萄球菌的检测方法有分离培养法、琼脂扩散法、乳胶凝集法以及血清学、PCR检测方法等,均较费时费力,不能满足快速检测的需要[３].荧光定量PCR技术提供了理想的检测方法.本文旨在建立一种金黄色葡萄球菌的特异、快速的检测方法,并对荧光定量PCR技术与国家标准分离培养方法进行比较,评价其效果,为金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食源性疾病提供了科学依据.１．材料与方法１．１仪器设备与试剂７３００型荧光定量PCR仪(美国ABI)公司;金黄色葡萄球菌核酸测定试剂盒(荧光PCR法)(上海之江生物科技有限公司);细菌培养用培养基为北京陆桥生物技术有限公司.１．２菌种１８株金黄色葡萄球菌阳性菌株为(哈尔滨市２０１３~２０１４年度食源性致病菌主动监测分离鉴定的菌株);大肠埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O１５７:H７等菌株由黑龙江省疾病预防控制中心提供.１．３模板DNA的制备按试剂盒核酸提取说明书进行.１．４反应体系与参数反应体系为４０ul;设置循环参数为:３７℃×２min;９４℃×２min;９３℃×１５sec;６０℃×６０sec,循环４０次,单点荧光检测在６０℃.荧光通道检测选择用FAM和HEX通道.２．结果２．１特异性试验对金黄色葡萄球菌及５种相关细菌进行检测,除金黄色葡萄球菌出现良好的扩增曲线,其它细菌均未出现曲线扩增.说明本方法对金黄色葡萄球菌有很好的特异性,与其它相关细菌无交叉反应(如图１).３．讨论金黄色葡萄球菌在人和动物中具有较高的带菌率,人的咽喉、鼻腔、皮肤、头发等常带有产肠毒素的菌株,故易于经手或空气...