文章编号:基于定量PCR技术的AcNPV-CarE病毒液滴度测定及酯酶表达条件优化李永强，袁国瑞，安凤秋，苏立德，冯俊涛，张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西省生物农药工程技术研究中心陕两杨凌西南大学植物保护学院重庆摘要：为了制备具有生物学功能的棉铃虫竣酸酯酶（）体外表达产物，用于研究其对有机磷等化学杀虫剂的代谢解毒作用，该文尝试将棉铃虫竣酸酯酶基因在草地夜蛾细胞系和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（）为载体的表达系统中进行表达，采用实时荧光定量技术測定棉铃虫竣酸酯酶基因和病毒载体重组体（）的病毒液滴度，并通过不同转染系数（）和不同收获时间下培养液中细胞体积单位变化趋势，以及表达产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和•乙酸茶酯染色结果，优化了棉铃由竣酸酯酶在细胞中的最佳表达条件结果表明：重组病毒液在细胞中扩大培养至第三代以后的病毒液（和）滴度均在/以上；釆用重组病毒液，在为，细胞体积单位为个/,转染后收获细胞沉淀.可得到具有酶湎的最大量竣酸酯酶表达产物上述结果为棉铃虫竣酸酯酶的异源真核表达和具有天然酶活表达产物的制备提供了有价值的参考关键词：酯酶；杆状病毒；病毒液滴度；转染条件；表达中图分类号：Q556文献标志码：A棉铃虫Helicoverpaarmigera属鳞翅冃昆虫在全世界许多国家利地区对棉花以及一些粮食作物都产生了严重危害早期主要使用有机磷拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类化学杀虫剂来控制其危害但是随着使用时间和规模的逐步扩大棉铃虫代谢抗药性随之产生这乂造成了另一个问题即用药量和次数也逐步加大导致农业生产成本捉高转基因棉花的问世和推广对棉花的生产产生了深远影响在很大程度上减少了化学农药的使用同时降低了对环境的污染但是近年来调查发现一些害虫对转基因植物也产生了抗性因而研究棉铃虫抗性产生的分子机制对于长期右效地控制棉铃虫对棉花等农作物的危害非常重要关于棉铃虫代谢抗性方面的研究国内已有不少文献报道例如研究发现棉铃虫细胞色素氧化酶在对有机磷等杀虫剂的代谢抗性中起着重要作用后来通过对来自亚洲的抗氤戊菊酯的棉铃虫品系和敏感品系的研究发现细胞色索氧化酶基因和的在抗性品系中存在过量表达在毕赤酵母表达系统的表达产物能代谢氤戊菊酯随后收稿H期基金项戸国家公益性行业农业科研专项基金资助项冃作者简介李永强-男陕西南郑人讲师主要从事农药学和昆虫生理生化研究通信作者张兴教授廨士生导师---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---等从棉铃虫抗性品系的中肠组织和脂肪休中分离出个拔酸酯酶电泳条带和发现对氤戊菊酯有代谢作用并鉴定出个竣酸酯酶基因彭梅等对同是鳞翅口的甜菜夜蛾的研究发现其体内包括竣酸酯酶在内的大代谢酶系的活性随着虫龄的增加|何增强以上研究说明细胞色素氧化酶系和竣酸酯酶等代谢酶系均与棉铃虫的代谢抗性有关但耍揭示各相关基因分别在棉铃虫代谢抗性中的作用和功能询需对一些抗性相关基因进行体外表达检测其対相关杀虫剂的代谢活性目前以昆虫细胞和杆状病毒为载体的表达系统是较为理想的足虫基因体外表达系统据报道铜绿蝇Luciliacuprina和黑腹果蝇Drosophilanielanopaster等体内与代谢抗性相关的竣酸酯酶基因先后均在昆虫细胞杆状病毒载体表达系统小进行了成功表达酶促动力学测定表明竣酸酯酶和表达产物对有机磷等杀虫剂具有高效代谢解毒作用从分子和生化水平证明了单个竣酸酯酶基因在代谢抗性中的作用此外韩建强等报道在昆虫细胞中成功表达了猪瘟病毒皋因但是截止1=1前尚未见棉铃虫竣酸酯酶基因在昆虫杆状病毒载体表达系统中表达的文献报道本文利用茸地夜蛾SpodopteraJ'ru^if）erda细胞系和来口肯蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Auto^raphacalifornica的杆状病毒载体为表达系统尝试对棉铃虫竣酸酯酶基因进行体外异源真核表达并采用实时荧光定量技术测定了重组病毒液的滴度以此为基础对竣酸酯酶表达条件进行了优化旨在为进一步研究棉铃虫竣酸酯酶对化学杀虫剂的酶促代谢作用奠定基础1材料和方法---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除------本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵...