慢病毒介导MCF―7细胞中FOXP2基因沉默体系的建立摘要：为了实现FOXP2基因在MCF-7细胞中稳定低表达，采用基因工程的方法构建pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒干扰载体，并将其与辅助质粒共转染HEK293T细胞，包装shFOXP2干扰慢病毒，收取病毒上清加入到MCF-7细胞中，培养48h，荧光定量PCR检测FOXP2的基因mRNA表达水平，WesternBlotting检测FOXP2蛋白表达水平.获得了pMAGic7.1-shFOXP2干扰载体，从而成功建立FOXP2基因稳定干扰的MCF-7细胞株，为进一步研究FOXP2在乳腺癌发生发展中的功能提供了研究材料.关键词：FOXP2；慢病毒载体；RNA干扰；乳腺癌MCF-7细胞：U44文献标志码：AAbstract：InordertoestablishaMCF-7celllinewithlentivirus-mediatedFOXP2genesilencingandconfirmitsinterferenceeffect，thelentiviralvector（pMAGic7.1-shFOXP2）wasconstructedbygeneticengineeringandcotransfectedwithpVSVG、Δ8.91intoHEK293Tcells，whichgeneratedthematurelentivirus，viralsupernatantwascollectedandaddedtoMCF-7cellsafter48h，themRNAandproteinlevelsofFOXP2wereexaminedbyqPCRandWesternblot.Thus，weconstructedandidentifiedthelentiviralrecombinantvectorpMAGic7.1-FOXP2，successfullyestablishedaMCF-7celllinewiththeinterferenceofFOXP2expression，asthesefindingsimplyapromisingstrategyforstudyingFOXP2functionsinbreastcancerprogression.Keywords：theforkheadboxp2；lentivirusvector；RNAinterference；breastcancerMCF-7cellsFOXP2基因位于7号染色体短臂31区域，属于FOX转录家族.叉头框蛋白（forkheadbox）家族是一类具有广泛功能的转录因子家族，它的DNA结合区是一个特殊的翼状结构，即螺旋转角螺旋蛋白结构，并且在生物进化中高度保守，此结构由100个氨基酸组成，包含3个α螺旋、3个β折叠以及2个大环结构[1].FOXP2蛋白包含一个谷氨酸富集区、一个FOX叉头框DNA结合区和一个由50个氨基酸组成的高度保守的N端，在N端能够形成锌指或亮氨酸拉链结构，这种结构是FOXP2与FOXP1和FOXP4相互作用形成同源二聚化?c异源二聚化所必需的[2-3].FOXP2转录后可剪切形成18种转录本，经过生物信息学和蛋白结构分析，预测出FOXP2下游靶基因结合基序5’-CAAATT-3’[4].FOXP2主要在胚胎发育、细胞分化和肿瘤的上皮间质转化过程中发挥着重要的功能.FOXP2（forkheadboxp2）最早发现与控制语言能力发展相关，通过研究发现，FOXP2第553位的精氨酸突变为组氨酸（R553H）能够引发严峻的先天性语言障碍疾病，并且FOXP2的缺失或者突变可能引发语言障碍及运动神经元系统紊乱[5-6].除此之外FOXP2在多种肿瘤细胞中表达与肿瘤的EMT发生发展有密切的关系，大量研究数据已经表明在骨肉瘤[7-9]、肝癌[10-12]、胃癌[13-14]可以抑制肿瘤转移的发生发展.Dung-Tsa[15]等发现FOXP2基因及蛋白存在于人的正常组织和乳腺癌组织中，并在具有侵染性的乳腺中的表达被抑制，但对于FOXP2如何调控乳腺癌发生发展的机制研究尚不清楚.因此，研究乳腺癌细胞中FOXP2转录因子调节EMT相关基因的分子机制，对认识乳腺癌细胞的转移并确认抑制靶点具有重大价值.对于细胞转染有多种方法，包括脂质体转染、磷酸钙转染、腺病毒感染和慢病毒感染，相比其它转染方法而言，脂质体转染和磷酸钙转染最为常见，但其转染效率会因细胞种类的不同而有所差异，并且脂质体的成本较高.生物实验中所用到的慢病毒载体大部分是以HIV为基础、人为改造的基因治疗载体，它的感染能力与细胞种类关系不大，感染的时候对细胞所处的生长时期没有特别的要求.只需要将目的基因片段连接到慢病毒载体中，目的基因会随着病毒基因的复制而复制，包装成新的病毒感染宿主细胞，被整合到宿主细胞的基因组上.由于辅助质粒不能被包裹于新的病毒内，所以病毒包装完成后，只具有感染细胞的能力，而不能在宿主细胞内再次形成新病毒，不会使宿主细胞裂解死亡，提高了生物安全性，大大节约成本[16-17].本文应用慢病毒的方法构建了FOXP2基因沉默的MCF-7稳定表达细胞株，为以后乳腺癌的临床治疗提供良好的素材和工具.1材料和方法1.1细胞和材料HEK293T细胞、乳腺癌MCF-7...