AfPGA催化合成头孢克洛工艺及其产物分离纯化实验分析陈雷1,2刘铖2朱良兴2李贺然1(通讯作者)(1苏州大学医学部药学院江苏苏州215123；2苏州中联化学制药有限公司江苏苏州215212)【摘要】目的木文通过实验考察了AfPGA催化合成头孢克洛的工艺及其产物的分离纯化方法，最终确定最优反应条件为.•pH(7.0)；温度(25°C);缓冲体系(磷酸钠);酶投入量(3U/mL)；底物浓度(7-ACCA60mmol/L,苯甘氨酸甲酯120mmol/L)。在此条件下底物转化率将达到85%以上，产物纯度可超过99.5%,杂质含量低于0.5%。【关键词】头孢克洛AfPGA工艺分离纯化【】R9【文献标识码】A【】2095-1752(2014)14-0117-03CefaclorAfPGAcatalyticsynthesistechnologyandproductpurificationexperimentanalysis[Abstract]thisthroughtheexperimentinvestigatestheAfPGAcatalyticsynthesisofcefaclorprocessandproductseparationandpurificationmethod,finallytheoptimalreactionconditionsweredeterminedas:pH(7.0);Temperature(25°C);(sodiumphosphatebuffersystem);Enzymemass(3u/mL);Thesubstrateconcentration(7-ACCA60mmol/L,methylphenylglycinetendencyfor120/L).Undertheconditionofthesubstrateconversionratewillreachmorethan85%,productpurityover99.5%,impuritycontentlowerthan0.5%.【Keywords】cefaclor;AfPGA.Process;Separationandpurification头孢菌素是抗牛.素类药物中的重要一族，目前己研发到第4代，但比较而言,第2代头孢类抗生素对beta;-内酰胺酶稳定，对阳性菌和阴性菌具有良好乂均衡的抗菌活性，其应用前景相对最佳。头孢克洛为第2代头孢类高效U服药物，其对肺炎球菌、溶血性链球菌、淋病奈瑟菌及厌氧菌等均具良好活性。但就头孢克洛的研制现状来看，既往采用头孢噬吩或是7-氨基头孢烷酸（7-ACA）作为原料均不十分理想，而在近些年来逐渐发展起来的生物化学、基因工程等技术为本品的合成指出了新的方向。粪产碱杆菌青霉素酰化酶（AfPGA）为青霉素酰化酶（PGA）家族中的一个独立分支，艽不仅对底物亲和力好，而且对热、酸碱度以及多数有机溶剂等均可表现出较高稳定性，基于此，本研究即以AfPGA为原料，继而对其经催化合成头孢克洛的工艺进行了一定探索，一并研究了相关产物的分离纯化方法及效果。1材料与方法1.1材料AfPGA、固定化载体（EupergitCM）、3-氯-7-氨基-3-头孢烯-4-酸（7-ACCA）以及苯甘氨酸甲酯等，其余相关试剂均采用分析纯。1.2实验方法1.2.1酶活力的测定采用对二氨甲基苯甲醛（PDAB）比色法，底物：青霉素G钾盐;底物溶液：以O.lmol/LpH8.0的磷酸钾缓冲液配制,最终浓度为40g/L,用酶在37°C条件下水解5min,以水解青霉素产生lmu;mol6-氨基青霉烷酸（6-APA）/min所需酶量为一个酶活单位（U）。1.2.2固定化酶的制备与修饰对EupergitCM采用去离子水进行浸泡并洗涤，重复操作以将悬浮颗粒除尽为宜，之后即可将艽置于缓冲液中并加入适量的游离酶溶液，再在低速摇床上反砬一段吋间，接着再用少量缓冲液进行多次洗涤，最后经抽滤即可得到固定化酶（IPA）。分别称取巯基乙醇（ME）与牛血清白蛋白（BSA）各25mg,以5ml磷酸钾缓冲液溶解后，再向其中加入lg（湿重）IPA，摇匀后室温状态保存20h，之后经抽滤即可得到修饰固定化酶（mIPA）。1.2.3头孢克洛酶法合成和底物转化率测定将7-ACCA与苯甘氨酸甲酯混合均匀并充分溶解，之后再加入PGA，进而考察不同温度、酸碱度、投量等条件下的合成转化率，具体计算方法：在反应结束并进行离心处理后，采用PDAB比色法计算。2结果与分析2.1确定固定化AfPGA吋间以EupergitCM载体对AfPGA固定化处理，在350U/mL液态酶活力条件下，磷酸钾缓冲液浓度与酸碱度同上，投酶量以载体计：500〜550U/g，温度：30°C,转速：150r/min。随固定化吋间的延长，固定化速率鼠键升高，但在40h后不再升高（图1）,故确定固定化AfPGA吋间为40h。2.3.2确定催化反应的最佳温度实验观察与检测结果显示，在25°C左右吋，转化率达到最高，见图3,II该温度既不会因为过高而对AfPGA的产物稳定性造成影响，也不会因为过低而增加能耗与延长反应吋间等，故将25°C确定为最佳反应温度。基于上述多项实验，确定...