鸡卵类粘蛋白的分离纯化活性及分子量测定

鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定摘要:鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid,简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白,它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用。采用有机溶剂沉淀法将鸡蛋清经三氯乙酸(TCA)—丙酮溶液处理,除去沉淀物,经丙酮分级沉淀活的粗品,再经过DEAE纤维素(二乙基氨基乙基纤维素)柱层析纯化而得合格产品,然后用Folin-酚法测定卵类粘蛋白的抑制活力测得纯蛋白的抑制活力大于粗蛋白的抑制活力,最后通过SDS-聚丙烯酰胺凝焦电泳测定蛋白质分子量测得粗蛋白的相对分子量为34311纯蛋白的相对分子量为32924与理论值有一定差距。关键词:鸡卵类粘蛋白;胰蛋白酶;有机溶剂;层析;电泳中图分类号:Q文献标识码:AIsolationandpurificationofCHOManditsactivity、molecularweightdeterminationAbstract:Chickenovomucoid(CHOM)isaglycoproteinmadefromchickeneggwhite,ithasastrongroleininhibitingtrypsin.Organicsolventprecipitationmethodusingeggwhitebytrichloroaceticacid(TCA)-acetonesolutionwastoremovesedimentbyacetoneprecipitationoflivecrude,throughtheDEAEcellulose(diethylaminoethylcellulose)columnlayerAnalysisofpurifiedproductsderivedfromqualified,thenFolin-phenolmethodovomucoidinhibitedactivity,andfinallybySDS-polyacrylamidegelelectrophoresisdeterminationofproteinmolecularweightofcoke.Keywords:CHOM;Trypsin;organicsolvent;chromatogram;electrophoresis.鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白,它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用[1],常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂,通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热度和高浓度的脲都是相当稳定的,在有机溶剂都有较高耐受性(在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度),而在碱性溶液中比较不稳定,尤其当温度较高时易迅速失活。鸡卵类粘蛋白的等电点有一定的范围,大致在pH3.9~4.5。分子量28000Da。采用有机溶剂沉淀法分级沉淀活的粗品。鸡卵类粘蛋白具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用,胰蛋白酶能水解酯键,酰胺键和肽键,利用这一性质用人工合成的底物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的活力,由此可计算卵类粘蛋白的活力。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可以重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。1材料与方法1.1材料:1.1.1试剂丙酮,0.5M三氯乙酸,0.02M,pH6.5磷酸缓冲液,DEAE-纤维素,DE-52,0.5M氯化钠-0.5M氢氧化钠溶液,0.5M盐酸,0.30M氯化钠-0.02M,pH6.5磷酸盐缓冲液,硫酸铵,pH8.0Tris-HCL缓冲液(每毫升Tris-HcL缓冲液含0.34毫克BAEE和2.22毫克氯化钙),0.4M三氯乙酸,2%酪蛋白,0.4M碳酸钠,Folin乙试剂,氢氧化钠,30%胶母液,PH8.9Tris-Hcl缓冲液,PH6.7s-Hcl缓冲液,无离子水,10%APS,染色剂,脱色剂等。1.1.2器材恒温水浴锅、新鲜鸡蛋、温度计、漏斗、透析袋、层析柱(2.8*38cm)、紫外分光光底计、部分收集器、紫外检测仪(包括记录装置)、贮液瓶(柱层洗洗脱用)、秒表、移液管、高速离心机、垂直板电泳槽、凝胶模样品梳、微量进样器等1.2方法:1.2.1粗品的制备:取1个鸡蛋得蛋清体积约29mL,盛于250mL烧杯内,放置于温水浴锅内使温度达到25-30℃,在不断搅拌下加入等体积的4℃预冷的三氯乙酸-丙酮溶液(体积比1:2),形成白色沉淀,调节pH至3.0,搅拌约30min,然后离心(4000r/min)20min。收集上清液。转入三角瓶里,置冰箱放置1周。缓慢加入大于等于2倍体积冷丙酮,直到白色沉淀产生,置冰箱中放置,离心(4000r/min)20min,弃清液,沉淀物加入2mL离子水,溶解沉淀,装入透析袋中对水透析以除去残留的TCA。一周后离心(4000r/m)20min,弃沉淀,量取溶液体积,加入1/10体积的0.2mpH6.5的磷酸缓冲液,摇匀,测量并记录粗品体积(13ml),供下步上柱纯化使用。1.2.2纯化(1)DEAE-纤维素的处理新纤维素的处理:取50克DEAE-纤维素32,用少量水溶胀1小时,用0.5M氯化钠溶液-0.5M氢氧...

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