焦磷酸测序检测慢性乙型肝病患者血清HBVP基因变异的临床价值刘先进吴月平(南通市第三人民医院江苏南通226006)【摘要】目的探讨核苷类药治疗不同时间段慢性乙型肝病患者血清乙型肝炎病毒聚合酶(HBVP)棊因焦磷酸测序结果的临床价值。方法运用焦磷酸测序仪器配套的软件AssayDesignSW在目的区域两端保守区域设计PCR引物及测序引物，采用套式PCR方法检测血清屮HBVDNA,按照PyroMarkID遗传分析系统用SNP模式进行PCR产物HBV相关位点的焦磷酸测序；40例慢性乙型肝病患者进行P基因变异、突变比率检测的同时测定HBVDNA、HBVM、ALT。结果40例患者屮18例发生变异，变异模式以经典突变L180M、M204V/I、A181V/T、N236T突变为主，加少量V173L、S202G突变；突变比率由20%到100%;HBVP棊因变异可以在HBVDNA、ALT发生突破前、屮、后检出；HBeAg、HBeAb阳性者P基因变异率分别为46.2%(12/26)、41.7%(5/12)(p>0.05),两例HBeAg、HbeAb均阴性者屮一例P基因区变异。结论焦磷酸测序可以快速、准确的检测出HBVP基因变异；HBVP基因变异模式、突变比率与核苷类药物敏感性密切相关。【关键词】乙型肝炎病毒P基因变异焦磷酸测序【屮图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2012)10-0380-03乙型肝炎病毒(HBV)突变，是引起肝病活动和导致核苷类抗病毒药物治疗失败的主要原因。临床上缺乏有效检测多位点、高通量和自动化程度好且适应于临床批量检测的方法。焦磷酸测序技术是一种新的依靠生物发光进行DNA序列分析的技术，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列的目的。我们采用该技术对40例接受核苷类药治疗的慢性乙型肝病患者不同时间段血清HBVP基因序列变异及突变比率进行检测，探讨其临床价值。资料与方法一、患者及标本来源对2008年12月-2011年6月南通市第三人民医院感染科送检的40例慢性乙型肝病患者血清标本进行HBVP基因分析，其中男性患者34例，女性患者6例。年龄22〜63岁。患者分别处于接受核苷（酸）类药物治疗前、中、后，有完整的核苻（酸）类治疗病史记录，单用拉米夫定（LAM）3例、阿德福韦酯（ADV）3例、恩替卡韦（ETV）3例、替比夫定（L-dT）3例，28例序贯治疗或联合治疗均在临床治疗欠佳或出现病毒学、其至生物化学突破时使用。二、方法（一）HBV血清标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb采用微粒酶免疫法检测（MEIA法，比0«试剂），血清中HBVDNA含量检测采用荧光PCR法（上海科华试剂）。（二）血清HBVDNA的抽提血清标本复融后，取50μl,加入50μl浓缩液,13000rpm离心lOmin；弃去上清，往沉淀中加入50ul裂解液，煮沸10min,13000rpm离心lOmin,上清作为PCR模板用于检测。（三）仪器及设备定性PCR扩增仪：PE9700；焦磷酸测序仪:Qiagen公司PyroMarkTMID遗传分析系统；ABI7500荧光PCR仪；雅培AXSYM免疫分析仪；奥林巴斯AU2700生化仪；WD-9413A凝胶成像仪凝胶成像仪。（四）引物设计和合成、PCR产物检查、PCR产物的焦磷酸测序委托南京迪安医学检验所完成。测序液照PyroMarkID遗传分析系统和配套试剂盒说明书，用SNP模式进行PCR产物HBV相关位点的焦磷酸测序。结果分析：根据检测序列的碱基序列判断突变类型，特奋的基因频率分析，可准确获得病毒突变株的比例。结果40例慢性乙型肝病患者抗病毒治疗吋间0-80月不等；5例患者基线吋进行变异株检测结果呈阴性；40例患者中18例发生变异占较高比例，其中单点变异M204V/I2例、A181V/T1例、V173L1例，两点或叁点变异分别为L180M+M204V/I7例、V173L+M204V/I1例、L180M+N236T1例、A181V/T+N236T1例、V173L+L180M+M204V/I2例、A181V/T+N236T+M204V/I1例，L180M+M204V/I+S202G1例,未检出I169T、T184G、A194T、M250V等突变；突变比率由20%到100%;变异株中M204V/I突变比率高(14例患者中12例为100%),未见单独L180M变异；HBVP基因区变异株可以在HBVDNA、ALT发生突破前、中、后检出；HBeAg、HbeAb阳性者P基因变异率分别为46.2%(12/26)、41.7%(5/12)(p>0.05),两例HBeAg、HbeAb均阴性者中一例P基因区变异。详细信息见表一。表一：40...