氯化钠促进溶菌酶聚集机制的分子动力学研究关婧,李辉,邹志远,何剑为,宋有涛*(辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳110036)[摘要]氯化钠能够在一定的条件下促进溶菌酶发生聚集,但其具体的作用机制还尚不明确.本文采用分子动力学模拟的方法研究了鸡溶菌酶单体在500mM的NaCl和不含NaCl两种体系中的结构变化.模拟的结果表明,一方面NaCl使得溶菌酶聚集关键区域(40-110位残基)内二硫键cys76-cys94的结合强度减弱,同时破坏了该区域内的氢键网络,从而导致了蛋白结构的不稳定性;另一方面,NaCl促使疏水核心发生了一定的扩张,使得疏水核心内氨基酸残基的结合变得更加松散,从而促进了溶菌酶分子间的相互作用.[关键词]溶菌酶;氯化钠;淀粉样聚集;分子动力学模拟[中图分类号]Q71[学科代码]1801450[文献标识码]A近年来,许多蛋白质错误折叠疾病,如阿尔茨海默病,疯牛病,帕金森氏病等,已经越来越被关注,它们的发生均与蛋白质的淀粉样纤维化沉积有关,但蛋白质淀粉样纤维化的机制目前尚不清楚[1,2].已有研究结果表明,这些蛋白的成纤维倾向除了与其序列和结构有一定的关系外,更重要的是与蛋白质所处的环境条件密切相关.生物内体液中的各种盐离子可通过与蛋白质的相互作用,使蛋白质分子能够保持正确的结构.一旦体液中的离子强度发生变化,蛋白质就可能产生错误折叠而生成淀粉样聚集体[3].溶菌酶广泛存在于鸟类的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳液、胎盘以及体液、组织细胞内,以蛋清中含量最丰富(约0.3%).迄今在世界上发现两种由溶菌酶突变导致的家族遗传性淀粉样变性病,患者主要在内脏中都产生了大量淀粉样蛋白的沉淀物,其致死原因是肾损伤或肝出血[4].溶菌酶蛋白家族具有高度的序列和结构保守性.作为该超家族的成员,鸡卵清溶菌酶蛋白同样具有淀粉样纤维化倾向[5].以鸡卵清溶菌酶作为模型,近年来美国的Clyston等通过酶交联的方法比较分析酸性条件下NaCl对溶菌酶聚集影响的结果表明,该蛋白从3%(500mM)浓度的NaCl梯度开始出现明显的聚集体并随着离子强度的增加而增多[6].另外,李文涓等通过采用荧光光谱法发现,在长时间热胁迫的情况下,NaCl可促进溶菌酶分子的聚集而纤维化[3].戴国亮等通过动态光散射法研究不同浓度NaCl溶菌酶生长晶体的影响时发现,较高浓度的NaCl可以诱导溶菌酶在溶液中形成较大的聚集体[7].这暗示着NaCl可能通过某种机制促进溶菌酶的构象改变,进而诱导溶菌酶发生了分子间聚集.但通过常规实验的方法对相关聚集的分子机制是很难得到的.较传统实验方法而言,基于测定的蛋白质三级结构和牛顿力学、量子力学的分子动力学模拟(moleculardynamicssimulation)能够利用计算机强大的计算能力模拟再现蛋白质纳秒数量级的结构变化过程,并在原子水平上提供有关蛋白结构变化的详细信息,可用于辅助并指导传统实验的研究.目前,这种技术已被逐渐应用于蛋白质错误折叠疾病分子机制的研究中[8,9].因此,本研究通过模拟分析酸性条件下500mMNaCl对鸡卵清溶菌酶单体稳定性的影响,从结构动力学的角度深入探讨NaCl促进溶菌酶聚集的分子机制.这对于探索蛋白质错误折叠疾病的机制,理解蛋白质在生命过程中的行为具有重要意义.[基金项目]国家自然科学基金（30970152）和辽宁省教育厅优秀人才项目（2009R26）资助。[作者简介]关婧（1985-），女，硕士研究生；宋有涛（1973-），通讯作者。男，教授，辽宁省动物资源与疫病防治重点实验室主任。Email:ysong@lnu.edu.cn1模拟方法和条件本文采用Gromacs4.0[10]软件将鸡卵清溶菌酶模型在500mMNaCl和不含NaCl两种体系中分别进行10ns分子动力学模拟,使用的力场为gromacs9643a1,模拟条件为温度298k(25oC),pH1.0.初始结构文件来自于RCSB数据库射线衍射三维坐标文件(PDB编号1GXV)[11].确定模拟体系的温度耦合采用“Berendsen-thermostat”法,耦合常数为0.1ps,压力耦合采用“Parrinello-Rahman”方法,耦合常数为0.5ps,参照压力为1.0×105Pa[12].采用标准立方盒包裹模型及其他分子,晶体置于盒子中心,选择溶质原子到盒子壁的距离为1nm以保证蛋白质有足够的构象变化空间).水溶液环境下采用SPC模型(29174个水分子),加入18个Cl-使体系电荷量达到平衡.然后在其中一个体系内加入500mM的NaCl.同时...