加味小柴胡汤对顺铂诱导BRL细胞核转录因子和热休克蛋白70表达的影响作者：刘应柯,张玉峰,宫璀璀,刘尚岭【摘要】目的观察加味小柴胡汤对顺铂诱导的大鼠肝BRL细胞核转录因子-kB(NF-kB)、热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法将BRL细胞分为4组：空白组、顺铂组及加味小柴胡汤大、小剂量组。采用完整细胞蛋白质斑点印迹、免疫组织化学等方法,检测各组细胞NF-kB、HSP70变化。结果顺铂组NF-kB表达明显较空白组升高,HSP70表达降低,组间比较差异有统计学意义；加味小柴胡汤大、小剂量组NF-kB明显较顺铂组低,差异有统计学意义；加味小柴胡汤大、小剂量组HSP70表达均升高,但仅加味小柴胡汤大剂量组差异明显。结论加味小柴胡汤可下调顺铂诱导的BRL细胞NF-kB表达,上调HSP70表达,此作用可能是该方减轻细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡重要机理之一。【关键词】BRL细胞；顺铂；加味小柴胡汤；细胞核转录因子-kB；热休克蛋白70Abstract：ObjectiveTostudytheeffectofmodifiedXiaochaihuDecoctiononNF-kBandHSP70ofBRLcellinducedbycisplatin.MethodsBRLCellsweredividedintocontrolgroup,cisplatingroup,highandlowdoseofmodifiedXiaochaihudecoction.CompletecellproteindotblottechniqueandimmunohistochemisthanalysiswereapplliedtodetectthechangeofNF-kBandHSP70.ResultsTherewasasignificantincreaseinNF-kBanddecreaseinHSP70ofBRLcellinducedbycisplatincomparedwithcontrolgroup.TherewasasignificantdecreaseofNF-kBinmodifiedXiaochaihudecoctiongroupcomparedwithcisplatingroup.TherewereincreasesoftheexpressionofHSP70inbothhighandlowdosegroup,butonlythehighdosegroupdemonstratedsignificantdifference.ConclutionTheexpressionofNF-kBofBRLcellinducedbycisplatincanbeinhibitedwhiletheexpressionofHSP70canbeenhencedbymodifiedXiaochaihudecoction.ItmaybeoneofimportantmechanismsofrelievingcelloxidizelesionandinhibitingapoptosisbymodifiedXiaochaihudecoction.Keywords：BRLcell；cisplatin；modifiedXiaochaihudecoction；NF-kB；HSP70核转录因子-kB(NF-kB)是一种能与免疫球蛋白k轻链基因的增强子kB序列特异结合的蛋白因子,具有多向转录调节作用,当细胞氧化损伤后NF-kB的表达增强[1]。热休克蛋白(HSP)是机体在各种应激性侵害时所产生的一种高度保守蛋白---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---质,HSP70是HSP中最重要的一种中等分子量蛋白,其表达能够对应激状态下细胞产生保护作用。HSP的细胞保护作用可能是恢复和维持抗氧化酶功能,修复其在应激状态时被破坏的功能蛋白,从而稳定细胞结构,使细胞维持正常的生理功能[2]。笔者利用体外细胞培养方法,观察了顺铂诱导BRL细胞应激反应损伤时NF-kB、HSP70的异常表达及加味小柴胡汤的调控作用。1实验材料正常大鼠肝BRL细胞,广州中山大学动物实验中心细胞库提供。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM、单克隆抗体、TUNEL检测试剂盒均购自Sigma公司。顺铂为齐鲁制药有限公司生产,批号0503007。加味小柴胡汤由中国人民解放军第153中心医院中药制剂室制备(原药材1g/mL)。2实验方法2.1细胞分组及处理取处于对数生长的BRL细胞随机分为4组(每组6瓶)。空白组：加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基；顺铂组：加入顺铂5mg/L及10%胎牛血清的DMEM培养基；加味小柴胡汤大剂量组：加入顺铂5mg/L、10%胎牛血清的DMEM培养基及加味小柴胡汤4mg/mL；加味小柴胡汤小剂量组：加入顺铂5mg/L、10%胎牛血清的DMEM培养基及加味小柴胡汤2mg/mL。在37℃、0.5%CO2培养箱中培养48h后,将胰蛋白酶消化的细胞制备成细胞混悬液。将收获的4组细胞分别制成细胞滴片(1×107/mL细胞混悬液滴加至预先处理过的硝酸纤维素膜和载玻片上)、细胞裂解液,并提取DNA和蛋白质,进行免疫组化检测。2.2完整细胞蛋白质斑点印迹采用间接酶标抗体免疫组化法：点膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的蛋白质,加0.5%吐温-20/TBS(Tris-HClpH7.2)封闭,加各自的一抗,0.01%吐温-20/TBS洗2次,加碱性磷酸酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG,加DAB/NBT-BCIP底物液进行...