手足口病的分子生物学监测陈竞1蔡燕2(1川北医学院牛物化学教研室四川省南充市涪江路234号川北医学院生物化学教研室637000)(2川北医学院附属医院检验科四川省南充市文化路8号川北医学院附属医院检验科637000)【摘要】目的木文通过对逆转录(RT)・聚合酶链反应(PCR)以及巢式PCR进行比较，最后确定哪一种方法的监测灵敏度更高。方法在肠道病毒的VP1-VP3区内设计EV71以及肠道病毒柯萨奇A16(CAV16)的引物，进而通过RT-PCR以及巢式PCR的监测方法对这些病毒的基因进行监测。结果逆转录■聚合酶链反应的方法对两种病毒的检测分别是EV71为79例(38.9%),CAV16为48例(23.6%)；巢式PCR监测方法是EV71为145例(71.5%),CAV16为59例(29.1%)。结论巢式PCR对于CAV16及EV71检测灵敏度更高。【关键词】手足口病分子牛物学逆转录■聚合酶链反应【1R725.1【文献标识码】A【J2095-1752(2012)03-0229-01手足口病的主要临床症状是发热以及手、足、口腔等部位出现皮疹、溃疡等临床表现。首次报道手足口病的国家是新西兰，接下来的数十年里，全球有20个国家有过该病的发牛［1］。引起手足口病的主要病原是肠道71型病毒，该病原菌亦可引发脑干脑炎、脊髓灰质炎样的麻痹及无菌性脑膜炎等神经系统的疾病。好发年龄为3岁以下的婴幼儿⑵。1资料与方法1.1一般资料随机选取2008年・2010年我院手足口病患者203例，年龄为3-11岁(3plusmn;0.5岁)，其中男109(53.7%)例，女94(46.3%)例。1.2方法1.2.1标本的收集方法收集手足口病急性期患者的粪便，约1・2克，储存于无菌的器皿中。收集患者咽部分泌物，置于2-3mLHanks液中，・70°C冻存。1.2.2引物的设计方法依据GenBank里面记载的EV端非编码区中的保守基因序列,同吋应用OLIGO5.0软件对EV71和CAV16的VP1・VP3区进行设计。1.2.3标本的RNA扩增及产物的检测RT-PCR反应体系为RT-buffer5mu;L,dNTP0.5mu;L,Mg2+1mu;L,AMV0.5mu;L,Taq0.5mu;L,R-primer0.5mu;L,L-primer0.5mu;L,NA3mu;L,ddH2O13.5mu;L。该方法的反应条件为：45°C逆转录45min,94°C预变性2min；94°C变性20s,45°C退火25s,72°C延伸30s,总共进行36个循环；72°C再延伸lOmin,进而对结果的阴性以及阳性进行比对。巢式PCR的反应体系为10buffer2.5mu;L,dNTPlmu;L,Taq0.5mu;L,R-primer0.5mu;L,Lprimer0.5mu;L,DNA2mu;L,ddH2018mu;L。反应条件为：94°C预变性2min；94°C变性20s,45°C退火25s,72°C延伸30s,与前面的方法一-样共进行36个循环；72°C再延伸lOmin,同样进行比对。最后，对PCR产物进行检测：应用1.2%琼脂糖凝胶电泳1.2%琼脂糖凝胶电泳1.2%琼脂糖凝胶电泳1.2%琼脂糖凝胶电泳对结果进行分析。2结果RT-PCR以及巢式PCR两种检测方法比较如见表1、2所示。表1所有标本RT-PCR结果结果EV71CAV16EV71+CAV16阴性124155170阳性794818表2所有标本巢式PCR结果EV71CAV16EV71+CAV16阴性5817445阳性1455945对于肠道病毒EV71检测的RT-PCR以及巢式PCR两种方法进行比较，P《0.05,有统计学意义，巢式PCR的检测方法的灵敏度明显有优势。对于肠道病毒CAV16检测的RT-PCR以及巢式PCR两种方法进行比较，P《0.05,结果有统计学意义，同样证实巢式PCR的检测方法的灵敏度明显有优势。两种方法对同时合并两种病毒的比较同样显示有显著差异，P《0.05,巢式PCR的检测方法的灵敏度同样有明显的优势。3讨论手足口病是一种常见的较温和的出疹性疾病，主要感染5岁以下儿童。已知引起该病的病原体达20余种，均属微小核糖核酸病毒科、人肠道病毒属，其中以CA16和EV71最常见，柯萨奇病毒A组的4、5、7、9、10型和B组的2、5、13型也是HFMD较常见的病原体⑶。本研究提示咽拭子以及粪便标本的检测发现，巢式PCR的检测方法与RT-PCR的检测方法相比有明显的灵敏度优势。希望可以为临床工作提供充分的依据，并且证实巢式PCR的检测方法更适合广泛应用于临床，为手足口病的病原检测做出突出的贡献。参考文献[1]沙爱龙，刘颖.手足口病的研究概况[J]・生命科学仪器,2007,11(5):13-15・[2]LinTwuSJ,HoMS,etal.Enterovirus71out-breaks,taiwan:occurreneeandrecognition[J].EmergInfectDis,2003,9(3):291-293.[3]周世力，杨帆，金奇，等.肠道病毒71型的研究进展卩]・病毒学报，2003,19(3):284-287.
