CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术CRISPR/Cas系统是由CRISPR基因座与其串联的Cas基因（CRISPR-associatedgenes,Casgenes）组成。根据CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白的种类和同源性，可将CRISPR/Cas系统区分成3种类型，即类型I、Ⅱ和III，这3种类型标志基因分别是cas3、cas9和cas10。在CRISPR/Cas系统中，类型ⅡCRISPR/Cas系统组成最为简单，除了含有标志基因cas9外，还含有另外三个基因(casl,cas2,和csn2或者cas4)。CRISPR/Cas9系统由三部分组成：反式激活crRNA（trans-activatingcrRNA，tracrRNA）、Cas基因（CRISPR-associatedgenes）和CRISPR基因座。1.反式激活crRNA反式激活crRNA是由反式激活crRNA的DNA序列转录的非编码序列。2.CRISPR基因座典型的CRISPR基因座由3部分组成：即位于5′端的前导序列(leader，L)，高度保守的同向重复序列(directedrepeat，R),以及长度相似的间隔序列(spacer，S)。Repeats含有回文序列，可以形成发卡结构。而Spacers比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。而在上游的前导区(Leader)被认为是CRISPR序列的启动子。3.cas基因类型II-A亚型的CRISPR/Cas9系统中有4个cas基因，分别为cas9、cas1、cas2和csn2，它们的表达产物主要发挥核酸酶切割作用。Cas9蛋白是CRISPR/Cas9系统的标志性蛋白，由1409个氨基酸残基组成，包括α-螺旋组成的识别区(REC)、由RuvC结构域与HNH结构域组成的核酸酶区以及位于C端的PAM结合区。Cas9与靶DNA的识别依赖于tracrRNA:crRNA复合体以及位于靶位点下游的PAM序列。Cas9蛋白含有HNH和RuvC功能域，HNH负责剪切与crRNA互补的DNA链，RucV负责剪切双链DNA的另一条链。由间隔序列相邻基序(protospaceradjacentmotIf,PAM)指导Cas9蛋白可以精准的切割外源DNA。PAM位于结合区域的上游并与结合区域相邻，通常是NGG(N为任意核苷酸，G为鸟嘌呤)3个碱基。Cas基因转录翻译为Cas蛋白，而CRISPR阵列经转录加工成更短的CRISPRRNA(crRNA)，最后引导Cas蛋白降解靶核酸。微生物将从外源遗传物质中获得spacer序列，然后将其插入到自身的重复序列中。当外源DNA再次入侵时，Cas蛋白结合crRNA后会靶向到该spacer区域。识别PAM序列后，Cas蛋白会将此外源DNA降解。CRISPR-Cas系统产生切割必需3个条件：Cas蛋白、RNA和PAM。Cas蛋白是发挥识别、切割的功能蛋白。而PAM被称为原型间区序列邻近基序，是CRISPR-Cas系统区分自我和入侵者的标记。当外源DNA入侵细菌时，CRISPR/Cas系统将其整合形成新的CRISPR重复回文序列。当外源DNA再次入侵时，重复序列中的CRISPR前体转录本在tracrRNA(trans-activatingcrRNA)的帮助下以及Cas核糖核酸内切酶的处理下形成小的crRNA(crisprRNA)。在crRNA的引导下，Cas核糖核酸内切酶与外源DNA结合并将其裂解，达到防御的目的。CRISPR/Cas系统的主要特点在于能够记忆和识别入侵过的外源DNA，并对其特异性降解。（1）间隔序列获得：外来入侵的噬菌体或质粒DNA的一小段DNA序列被整合到宿主菌CRRSPR基因座的5′端的两个同向重复序列之间。（2）crRNA的产生：CRISPR基因座首先被转录产生非编码的前体pre-crRNAs，反式激活tracrRNA与pre-crRNA结合形成tracrRNA:pre-crRNA双链复合物。该复合物在Cas9的存在下，双链RNA特异的核糖核酸内切酶RNaseIII进一步切割，最终产生成熟的crRNAs。（3）免疫干扰：crRNA:tracrRNA:Cas9三元复合物扫描外源入侵DNA，当遇到原间区序列邻近基序（PAM），且DNA序列可与crRNA互补配对形成一个R环时，Cas9蛋白将分别利用HNH与RuvC结构域核酸内切酶活性对DNA的互补链与非互补链进行切割，而形成DNA的双链断裂。在实际操作中，为了更加简单的操作，Jinek等通过接头将crＲNA和tracrＲNA合并成为1条ＲNA链，从而形成单一指导ＲNA(single－guideＲNA，sgＲNA)。人工设计gＲNA时，结合的区域也就是20nt，其位于gＲNA的5＇末端，作为指导序列靶序列互补配对。简单来说，改造后的CＲISPＲ/Cas9系统仅需要在sgＲNA指导下，就能完成Cas9蛋白对特定位点的剪切在基因敲除中的应用：CRISPR/Cas9系统在基因组的靶...