药理学专业毕业论文[精品论文]白念珠菌CYP51免疫原性肽多克隆抗血清的制备与鉴定关键词：白念珠菌CYP51多克隆抗体制备工艺摘要：白念珠菌是临床最常见的致病真菌，在系统性真菌感染病例中，有50％-60％的病例是由白念珠菌感染引起的，同时由于长期广泛的预防性和治疗性使用氮唑类抗真菌药(如氟康唑)，90％以上的白念珠菌一经用药会出现不同程度的耐药性。文献表明，白念珠菌CYP51蛋白与耐药作用关系非常密切。白念珠菌CYP51蛋白即羊毛甾醇14α-去甲基化酶，药物与CYP51中的血红素铁相结合，阻止酶底物羊毛甾醇及分子氧与CYP51结合，影响羊毛甾醇14α-甲基的羟基化反应，进而抑制真菌细胞膜中的主要甾醇成分麦角甾醇的生物合成，从而产生抗真菌作用。从基因水平上研究白念耐药的分子机理，必须对相关基因的蛋白表达差异进行鉴定。抗体作为体液免疫应答的主要效应分子，能特异性地识别和结合相应抗原。过去的研究证明：通过免疫组化方法可以研究某个基因编码产物．蛋白的组织分布、细胞内定位；通过免疫共沉淀方法可以知道与它相互作用的蛋白；通过各种阻断实验或中和实验可以知道蛋白的功能。本文采用融合蛋白表达技术，使用Goldgene等软件对CYP51基因的抗原表位进行多点预测，确定对应于该氨基酸序列的cDNA序列，从而设计引物，采用PCR法从白念珠菌基因组中扩增出目的基因；选择常用于融合蛋白表达的pGEX系列载体，进行目的基因片段与质粒的切割与连接，成功构建了表达载体；转化大肠杆菌感受态细胞并筛选转化子，同时通过选择最佳诱导时机、最佳收菌时间和最佳IPTG浓度、探索出了适合GST-CYP51融合蛋白的最佳诱导条件，进而培养并诱导融合蛋白表达；并对融合蛋白进行了成功复性，使用谷胱甘肽琼脂糖亲和柱层析纯化，将菌液中带有GST担体的融合蛋白洗脱收集，免疫新西兰大耳白兔，制备多克隆抗血清，从而为CYP51基因缺失菌株与高表达菌株的鉴别提供诊断试剂，并为其蛋白质组学研究提供物质基础。---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---正文内容白念珠菌是临床最常见的致病真菌，在系统性真菌感染病例中，有50％-60％的病例是由白念珠菌感染引起的，同时由于长期广泛的预防性和治疗性使用氮唑类抗真菌药(如氟康唑)，90％以上的白念珠菌一经用药会出现不同程度的耐药性。文献表明，白念珠菌CYP51蛋白与耐药作用关系非常密切。白念珠菌CYP51蛋白即羊毛甾醇14α-去甲基化酶，药物与CYP51中的血红素铁相结合，阻止酶底物羊毛甾醇及分子氧与CYP51结合，影响羊毛甾醇14α-甲基的羟基化反应，进而抑制真菌细胞膜中的主要甾醇成分麦角甾醇的生物合成，从而产生抗真菌作用。从基因水平上研究白念耐药的分子机理，必须对相关基因的蛋白表达差异进行鉴定。抗体作为体液免疫应答的主要效应分子，能特异性地识别和结合相应抗原。过去的研究证明：通过免疫组化方法可以研究某个基因编码产物．蛋白的组织分布、细胞内定位；通过免疫共沉淀方法可以知道与它相互作用的蛋白；通过各种阻断实验或中和实验可以知道蛋白的功能。本文采用融合蛋白表达技术，使用Goldgene等软件对CYP51基因的抗原表位进行多点预测，确定对应于该氨基酸序列的cDNA序列，从而设计引物，采用PCR法从白念珠菌基因组中扩增出目的基因；选择常用于融合蛋白表达的pGEX系列载体，进行目的基因片段与质粒的切割与连接，成功构建了表达载体；转化大肠杆菌感受态细胞并筛选转化子，同时通过选择最佳诱导时机、最佳收菌时间和最佳IPTG浓度、探索出了适合GST-CYP51融合蛋白的最佳诱导条件，进而培养并诱导融合蛋白表达；并对融合蛋白进行了成功复性，使用谷胱甘肽琼脂糖亲和柱层析纯化，将菌液中带有GST担体的融合蛋白洗脱收集，免疫新西兰大耳白兔，制备多克隆抗血清，从而为CYP51基因缺失菌株与高表达菌株的鉴别提供诊断试剂，并为其蛋白质组学研究提供物质基础。白念珠菌是临床最常见的致病真菌，在系统性真菌感染病例中，有50％-60％的病例是由白念珠菌感染引起的，同时由于长期广泛的预防性和治疗性使用氮唑类抗真菌药(如氟康唑)，90％以上的白念珠菌一经用药会出现不同程度的耐药性...