药物生物技术PharmaceuticalBiotechnology2006,13(1:040~044一种丝状真菌活细胞生物量测定方法的研究3刘伯宁,乔长晟,贾士儒3(天津科技大学生化工程研究室,天津300222摘要研究了一种基于测定脱氢酶活(DHA的生化方法,用以测定真菌活细胞生物量和评价菌丝活力。四唑盐(TTC在活细胞体内经脱氢酶还原生成红色甲臜(TF。以氢化可的松生产菌株Abasidiacoerulea为模式菌,通过优化染色时间(60min、温度(45℃、pH值8.0,提高了该方法的灵敏度。活细胞湿重与吸光度线形相关(r2=0.98,验证了该方法的有效性。另外,使用优化后的方法,所测脱氢酶比活力可以用来准确评价菌丝体活力。关键词丝状真菌;活力;四唑盐;脱氢酶活;蓝色犁头酶:Q55文献标识码:A:100528915(20060120040205丝状真菌在微生物制药领域有着广泛的应用。但是,目前缺乏有效的方法测定其活细胞生物量和评价菌丝体活力。丝状真菌在液体培养过程中,菌丝易缠绕形成菌丝球,造成培养液不均一。以氢化可的松生产菌株蓝色犁头霉(Abasidiacoerulea,Ac为例,培养过程中菌丝球形态变化较大。传统的活菌计数法如:血球板计数法、平皿菌落计数法和MPN法等,均不适用于测定其活细胞生物量。目前,发酵过程中生物量的测定,多采用菌体干重或湿重法。菌体重量可以体现发酵液中生物质的多少,但不能反映菌丝生理状态,衰老程度,甚至不能区分细胞死活。微生物发酵工业要求生产菌株有足够的活细胞生物量(或转化活性,才能实现产物的大量积累。这样,菌体重量作为发酵过程的控制参数,意义有限。建立一种能够快速测定真菌活细胞生物量,有效评价菌丝体活性的检测方法,对于更好的控制发酵过程显得十分重要。从真菌生理代谢的角度出发,物质代谢和能量代谢密切相关。能量代谢的关键是细胞中有机物氧化分解产生氢,经呼吸链氧化释放能量。脱氢酶是呼吸链的主干酶系,它们可以把基质氧化脱下的氢,交给呼吸链传递释放出能量,用于生物合成和维持细胞的生命活动。因此测定真菌体内脱氢酶活,可以表征菌丝的生理活性,反映被测样品中的活细胞生物量。测定细胞内脱氢酶活通常使用四唑盐系列化合物(TTC、MTT、INT和XTT。无色TTC(2,3,52氯化三苯基四唑作为人造受氢体,它在细胞呼吸过程中接受氢,还原成三苯基甲臜(TF。后者以红色晶体的形式存在于细胞内,采用有机溶剂(如甲苯、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮或乙醇等进行萃取。萃取液测定吸光度后,根据标准曲线计算TF生成量,进而求出TTC2脱氢酶活性(TTC2DHA[1]。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种蓝色犁头霉(AbasidiacoeruleaAS365,本研究室保藏菌种。1.1.2培养基斜面培养基:PDA培养基液体培养基(g/L:葡萄糖15,酵母膏2.7,玉米浆10,硫酸铵6,pH值6.4~6.71.1.3菌体的培养与收集活化后的蓝色犁头霉菌株AS365,制成浓度为107~108/ml的孢子悬浮液,以5%的接种量接种到装液量为50ml的250ml锥形瓶中。28℃,160r/m培养24h,培养液0.08MPa真空抽滤10min,无菌水洗涤3次收集菌体。取上述收集的部分菌体,121℃灭菌20min,灭活菌体用滤纸吸去水分后备用。1.1.4仪器日本岛津UV22401PC型分光光043收稿日期:2005206210修回日期:2005209205作者简介:刘伯宁,1978年生,男,河北省人,在读硕士研究生3通讯作者:贾士儒,Tel:022*********,E2mail:shrjia@public.tpt.tj度计。1.2方法1.2.1TTC工作液的配制称取25mg烘干的TTC置于25ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,作为TTC母液(1mg/ml备用。将TTC母液稀释成浓度为10,20,30,40,50,60μg/mlTTC工作液。1.2.2TF标准曲线的制定取1ml不同浓度的TTC工作液(对照为1ml蒸馏水,加入1ml20%Na2S[2]新配溶液,摇匀。反应1h后,各管分别加入8ml丙酮溶解TF。反应液在485nm处,测定吸光度,绘制标准曲线,并求出TF摩尔消光系数。1.2.3公式计算在最适条件下,每秒钟使1mol的TTC转化为TF所需的酶量定义为一个Kat单位(=1012pKat。每克菌体湿重所含的TTC脱氢酶量为TTC脱氢酶比活力(SpecificDHA。DHA=(γ×V×109/(E×60DHA:脱氢酶活(pKatγ:TTC还原反应初速度(A/minV:TF萃取液体积(mlE:TF摩尔消光系数[L/(molocm]SpecificDHA=DHA/wSpecificDHA:脱氢酶比活力(pKat/gDHA:脱氢酶活(pKatw:菌体湿重(g1.2.4测定方法的优化称取0.1g湿菌体,加入3ml0.5%TTC2PBS(pH值7.5染...