复合诱变选育高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌第25卷第3期2021年9月青岛大学(工程技术版)JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY(ET)Vo1.25NO.3Sep.2021:1006—9798(2021)03—0089—06复合诱变选育高产3一羟基丁酮枯草芽孢杆菌尹明浩,徐慧.,程殿林,王勇(1.青岛大学生物系,山东青岛266071;2.天津科技大学生物工程学院,天津300457)摘要:选育高产3一羟基丁酮枯草芽孢杆菌,将一株枯草芽孢杆菌YD一1作为出发菌株,通过紫外线,硫酸二乙酯反复诱变处理,选取每一轮发酵3一羟基丁酮产量最高的菌株进入下一轮诱变.结果说明,菌株的复合诱变条件是在照射距离为25cm时紫外诱变30S后再经10%的硫酸二乙酯诱变处理30min,然后进行有利突变株的筛选,通过初筛,复筛和遗传稳定性试验,获得1株遗传性状稳定的3一羟基丁酮高产菌,其产量高达19.02g/L,比诱变前提高了5O.95,其遗传物质经RAPD分析,与出发菌株YD一1相比有较大差异.得到的枯草芽孢杆菌新菌株3一羟基丁酮产量高而残糖量低.关键词:3一羟基丁酮;枯草芽孢杆菌;复合诱变;RAPD:Q939.97文献标识码:A3一羟基丁酮具有特有的奶油香味,除了用作奶油,干酪,咖啡的香味增强剂外,还可作为一种重要的化合物来合成多种稀有药物和药物中间体,制造特香型烤烟等.作为一种食用香料,我国GB2760--86已明确规定允许其食用口].目前,3一羟基丁酮的生产方法主要有3种:化学合成法,酶法转化和微生物生产法.化学合成法和酶法转化都是以丁二酮或2,3一丁二醇为原料E,区别在于酶法转化产物得率高,没有其它副产物,但要获得大量特异性的酶比拟困难.丁二酮和2,3一丁二醇本身也是合成香料,而非大宗化工产品,原料及价格都受到限制,这是当前限制3一羟基丁酮大规模生产的原因之一.与前二者相比,微生物发酵法具有工艺简单,条件温和,原料广泛,价格廉价等优点,是3一羟基丁酮最有潜力的生产方法.但目前有关微生物生产3一羟基丁酮的文献,大多为代谢途径理论方面的研究,少数涉及3一羟基丁酮生产的报道也主要是作为丁二酮和2,3一丁二醇发酵的副产物提及_3].因此,诱变筛选一株高产3一羟基丁酮的菌株具有极其重要的科研意义和现实意义.本实验采用紫外一硫酸二乙酯复合诱变的方法,选育出一株高产3一羟基丁酮的枯草芽孢杆菌.1材料与方法1.1材料,主要试剂及仪器1.1.1出发菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YD一1,本实验室保存.1.1.2主要培养基1)斜面培养基(g/L):酵母粉5;硫酸锰0.1;蛋白胨10;氯化锰1;琼脂20;pH7.0.2)种子培养基(g/I):葡萄糖80;硫酸铵1;酵母粉5;玉米浆10;磷酸氢二钾1;pH7.0.3)发酵培养基(g/L):葡萄糖120;玉米浆10;酵母粉5;硫酸铵l_5;硫酸锰0.05;pH7.0.1.1.3试剂收稿日期:2021—05—05作者简介:尹明浩(1984一),男,硕士研究生,研究方向为微生物工程.通讯作者:程殿林,教授.Email:chengdianlin@163.eom90青岛大学(工程技术版)第25卷10的硫酸二乙酯(DES):取0.2mL硫酸二乙酯,参加1.8mI无水乙醇,混合均匀;25硫代硫酸钠:硫代硫酸钠25g,用水定容至100mL;缓冲液:0.2MNaHPO～NaHP,pH7.0;随机引物由上海生物工程公司合成,共2O个引物;TaqDNA聚合酶,dNTPs,RNase购自大连宝生物工程公司;其他常规试剂为国产分析纯.1.2实验方法1.2.1枯草芽孢杆菌发酵工艺取斜面菌种一环,接种于盛有30mL种子培养基的250mL三角瓶中,180r/rain,37℃摇床培养18h.取2mL培养液转接入另一只盛有30mL发酵培养基的三角瓶中,37℃摇床培养3d.1_2.2肌酸甲奈酚法测定3一羟基丁酮-在碱性条件下,3一羟基丁酮可与肌酸和甲萘酚生成粉红色复合物,该复合物在530nm处有最大吸收峰.取8支干净比色管分别加人3一羟基丁酮标准溶液和显色剂,6O℃显色反响15min,721分光光度计530nm测吸光值(OD值),以OD值为纵坐标,3一羟基丁酮含量为横坐标绘制3一羟基丁酮标准曲线,如图1所示.计算公式为T一00224V××10l●……V式中,丁为3一羟基丁酮含量,g/L;V为样品体积,mL;A涮为吸光度;为稀释倍数.1.2.3复原糖浓度的测定利用DNS法I6]测定复原糖含量.1.2.4紫外诱变及菌株筛选将培养6h的菌悬液进行梯度稀释,调整细胞质量浓度为1x1O个/mL,取1OmL置于9cm培养皿中(内置3一羟基丁酮质量仉g图13一羟基丁酮标准曲线一灭菌处理的磁力搅拌针),置于紫外诱变箱的磁力搅拌器上,调整照射距离为25cm...