21卷3期2005年5月生物工程学报ChineseJournalofBiotechnologyVol.21No.3May2005RedΠET重组及其在生物医学中的应用RedΠETRecombinationanditsBiomedical王军平13,张友明2WANGJun2Ping13andZHANGYou2Ming211,重庆40003821基因桥研究室,11StateKeyLaboratoryof,andInjury,InstituteofCombinedInjury,CollegeofPreventiveMedicine,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,21GeneBridgeGmbH,Dresden01307,Germanyαβ系统而建立的DNA—工程平台摘要通过应用Rac噬菌体的RecEΠRecT和λ噬菌体的RedΠRed——RedΠET重组,是一种不依赖于限制性内切酶的分子克隆新技术。运用该技术能够介导PCR产物或寡核苷酸对目标基因进行剪切、插入、融合及突变等多种操作,在生物医学领域里具有广阔的应用前景,尤其在基因组功能研究中对BACs、PACs和细菌染色体的打靶修饰以及基因敲除动物DNA靶分子的快速构建等方面最有效。随着RedΠET重组的推广与应用,该技术本身也在不断被改进,在工作效率得到显著提高的同时,其操作也变得更加简单、省时、省力。结合自身的一些研究结果,对RedΠET重组的技术特点、发展现状和在生物医学中的应用进行了详细阐述。关键词RedΠET重组,DNA修饰,BACs,噬菌体Q78文献标识码A100023061(20050320502205AbstractRedΠETrecombination,apowerfulhomologousrecombinationsystembasedontheRedoperonofλphageorRecEΠRecTfromRacphage,providesaninnovativeapproachforDNAengineering.Deletion,insertionandmutationcanbequicklyandpreciselyperformedonthetargetgenemediatedbyRedΠETrecombinationwithPCRderivedDNAfragmentsoroligonucleoti2des.Thistechnicalplatformhasextensiveapplicationsinbiomedicalfieldincludingbacterialartificialchromosomemodification,geneknock2outconstructionandgeneticmodificationofE.colistrainsaswellassomeotherkindsofmicroorganisms.Recently,RedΠETrecombinationwasimprovedinseveralaspectssothatitbecomesmorepowerfulandmaneuverable.ThecharacteristicanddevelopmentofRedΠETrecombinationanditsbiomedicalapplicationsweredescribedinthisrevieKeywordsRedΠETrecombination,DNAmodification,bacterialartificialchromosomes,phage随着包括人类基因组计划在内的各种基因组测序工程的实施与完成,以序列信息为基础的基因组功能研究随即成为生命科学领域的又一重大课题[1]。相对于测序工程,基因组的功能研究就更加复杂和困难。对于某一特定基因,要想彻底了解其生物学作用,往往需要对包含基因完整信息的基因组DNA进行克隆、删除、突变等多种修饰,从而为后续的表达和功能研究奠定基础。一般情况下,一个完整的哺乳动物基因包括内含子、外显子以及启动子等调控元件在内的全长DNA序列都在几十甚至上百个kb,另外,还有很多基因是以基因簇形式存在。这种包含完整基因信息的基因组DNAReceived:December29,2004;Accepted:March4,2005.ThisworkwassupportedbygrantsfromTheNationalNaturalSciencesFoundationofChina(No.30230360andTheTMMUFoundationforreturnee.3Correspondingauthor.Tel:86223268752283;E2mail:wangjunp@yahoo.com国家自然科学基金资助项目(No.30230360,第三军医大学留学回国人员启动资金资助。王军平等:RedΠET重组及其在生物医学中的应用通常是经过建库方式被装载于BACs(bacterialartificialchro2mosomes或PACs(P1artificialchromosomes等大容量载体503PCR将同源臂直接加在供体打靶片段的两侧。经RecEΠRecT介导,两端带有同源臂的供体分子就能直接插入到受体DNA靶分子的同源区部位。通过改变同源臂的区域和它们中间的打靶序列,人们就可以达到对DNA靶分子进行插入、剪切等多种目的。同理,如果将50bp的同源臂放在线性质粒载体的两端,通过该系统还可直接克隆或亚克隆DNA靶分子。由于同源臂可以人为选择,和DNA分子大小的限制,ET克隆可以对任意大的DNA中[2,3]。对如此大的DNA分子,此时很难应用PCR和限制酶等传统分子克隆技术对其进行修饰。另外,由于限制性内切酶和PCR都是在体外(invitro对DNA分子进行操作,所以碱...