加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经脑源性神经生长因子表达的影响作者：熊丽丽,陈泽奇,黄娟,傅擎宇【摘要】目的观察加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经脑源性神经生长因子(BDNF)表达的影响,探讨其对实验性糖尿病大鼠周围神经病变的防治作用。方法用1%链脲佐菌素诱发糖尿病模型,72h后尾静脉采血测定血糖,凡血糖＞16.7mmol/L者纳入实验。造模稳定1周后，加味补肝汤组予加味补肝汤灌胃[28.6g/(kg·d)],分别于用药后第4、8周2个时间点处死大鼠,用免疫组织化学法检测坐骨神经中BDNF蛋白的表达,通过MoticImagesAdvanced彩色图文分析系统测定免疫反应产物BDNF蛋白的灰度值。结果在4、8周模型对照组坐骨神经中BDNF阳性的表达比正常对照组明显减少(P＜0.05),第8周时BDNF表达比4周时增多。经加味补肝汤治疗后BDNF的阳性表达比模型组表达明显增多(P＜0.05)。结论加味补肝汤能上调糖尿病大鼠坐骨神经中BDNF的表达,对糖尿病大鼠周围神经病变有一定的防治作用。【关键词】加味补肝汤；糖尿病周围神经病变；坐骨神经；脑源性神经生长因子；大鼠Keywords：激aweiBugandecoction；diabeticperipheralneuropathy；sciaticnerve；brain-derivedneurotrophicfactor；rat神经病变是糖尿病最常见的并发症,包括周围神经病变和中枢神经病变,尤以前者多见[1]。通过多年的临床观察,加味补肝汤对糖尿病周围神经病变(DPN)有明显的疗效。前期研究表明,加味补肝汤对链脲佐菌素(STZ)诱导的DPN大鼠有减轻病情的作用[2]。为了进一步探讨加味补肝汤对DPN的保护作用,本研究以STZ诱发实验性DPN模型,研究脑源性神经营养因子(BDNF)在糖尿病周围神经病变中的保护作用。1实验材料1.1动物选用健康清洁级8周雄性Wistar大鼠60只,体质量220～270g,上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,许可证号：SCXK(沪)2003-003。1.2主要试剂和仪器Shandon325型石蜡切片机(英国Shandon),德国罗氏公司ACCU-CHEC血糖仪,MoticImagesAdvanced彩色图文分析系统(MOTICCHINAGROUP---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---CO.LTD),STZ(美国Sigma),兔抗BDNF多克隆抗体、即用型SABC试剂盒(武汉博士德),DAB显色试剂盒(北京中山生物技术公司),其他试剂由中南大学湘雅医院药房提供。1.3药物加味补肝汤由枸杞15g、木瓜15g、当归10g、川芎10g、熟地黄12g、白芍15g、桑寄生15g、麦冬15g、天花粉15g等组成,以28.6g/(kg·d)灌胃(按体表面积计算70kg体质量成人临床用量的等效量)。2实验方法2.1分组及造模Wistar大鼠60只适应性喂养1周,按照SAS统计软件包产生的随机表,随机将大鼠分为正常对照组20只、模型组20只、加味补肝汤组20只。模型组和加味补肝汤组大鼠禁食12h后,一次性腹腔注射1%的STZ(50mg/kg,pH4.2～4.5,0.1mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制)诱导糖尿病大鼠模型。造模后12h内饮用糖水,随后饮用自来水,72h后尾静脉采血测定血糖,凡血糖＞16.7mmol/L者纳入实验。正常对照组20只大鼠禁食12h后一次性腹腔注射相应容积的0.1mol/L柠檬酸缓冲液,造模稳定1周后加味补肝汤组用中药加味补肝汤灌胃治疗。模型组和正常对照组则用等体积的蒸馏水灌胃治疗,实验期间自由饮水。用药后分别于4、8周测大鼠体质量和血糖。2.2标本提取分别于用药后第4、8周一次性腹腔注射10%的水合氯醛(350mg/kg)麻醉,剑突下横切口,沿膈肌与胸廓交界处剪开膈肌,剪断两根肋骨,暴露心脏,用针头与心尖左缘成45o～60o方向向上进针,插入升主动脉(同时剪开右心耳)固定针头,快速滴入37℃生理盐水100mL,无血污后改为滴入固定液(4℃,40g/L多聚甲醛PBS1mL/min)250mL。后俯卧位固定,取左侧梨状肌下缘坐骨神经约1cm,置于4%多聚甲醛中固定24～48h,常规脱水,石蜡包埋,连续切片,片厚约5μm,每隔20张取2张贴于多聚赖氨酸处理的玻片上,烤干后4℃保存,留做免疫组化检测。2.3指标检测免疫组织化学检测坐骨神经内BDNF的操作步骤如下：二甲苯常规脱蜡,100%、95%、80%、70%酒精梯度水化,蒸馏水充分浸洗；3%H2O2-甲醇灭活内源性过氧化物酶20min,0.01mol/LPBS(下同)洗5min/次×3次；EDTA水浴修复抗原,PBS洗5min/次×3次；滴加5%BSA封闭液,置湿盒中37℃孵育30min后,甩去多余液体,勿洗；滴...