非小细胞肺癌中MAGE-1蛋白的Western印迹分析【摘要】目的检测黑色素瘤抗原-1（MAGE-1）蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达，探讨以该蛋白作为疫苗对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性。方法采用Western印迹法对3种人肺癌细胞系和56例NSCLC标本及相邻正常肺组织标本MAGE-1蛋白的表达情况进行研究。结果3种人肺癌细胞系均表达MAGE-1蛋白；56例NSCLC标本中，25例表达MAGE-1蛋白，而相邻正常肺组织均不表达。结论MAGE-1蛋白在NSCLC中呈高频率表达，提示该蛋白有望成为对NSCLC患者进行免疫治疗的适宜靶点。【关键词】肺肿瘤非小细胞肺癌黑色素瘤抗原-1免疫治疗Western印迹【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）28-0133-02【Abstract】ObjectiveTodeterminetheexpressionofmelanomaantigen-1(MAGE-1)proteininnon-smallcelllungcancer(NSCLC)andtoexplorethepossibilityofusingthisproteinasavaccineforimmunotherapyforNSCLCpatients.MethodsTheexpressionofMAGE-1proteinin3humanlungcancercelllinesand56NSCLCsamplestogetherwiththeadjacentnormallungsampleswasexaminedbyWesternblot.ResultsAll3humanlungcancercelllinesexpressedMAGE-1protein.Ofthe56NSCLCsamples,25expressedMAGE-1protein,whereasnoneoftheadjacentnormallungsamplesexpressedMAGE-1protein.ConclusionMAGE-1proteinisexpressedatahighfrequencyinNSCLCsamples,andthisproteinmaypossiblybethesuitabletargetforimmunotherapyforNSCLCpatients.【Keywords】LungneoplasmsNon-smallcelllungcancerMelanomaantigen-1ImmunotherapyWesternblot黑色素瘤抗原-1（MAGE-1）基因是最初在恶性黑色素瘤中发现的一种肿瘤抗原基因，其编码的抗原MZ2-E可以与人类白细胞抗原HLA-A1结合，被自体细胞毒T淋巴细胞（CTL）识别，使CTL产生特异性杀伤肿瘤细胞的效应[1]。本研究旨在检测MAGE-1蛋白在国人非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达情况，探讨以该蛋白作为疫苗对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性。1材料和方法1.1细胞系与标本以人肝癌细胞系SMMC-7721作为阳性对照[2]，以小鼠成纤维细胞系3T3TK作为阴性对照。人肺腺癌细胞系SPC-A-1购自中科院细胞库，SMMC-7721、3T3TK、人肺癌细胞系A549、A431均由上海长征医院全军临床免疫中心细胞免疫室提供，上述细胞系均贴壁生长于含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液中。56例NSCLC和相邻正常肺组织标本取自上海长征医院胸心外科1998年11月至2000年2月的手术病例，其中男35例，女21例，年龄33～75岁，平均64.4岁，术后病理证实为鳞状细胞癌29例，腺癌25例，大细胞癌2例。1.2电泳样品制备用PBS洗涤贴壁生长的培养细胞3次，加入0.2mlLoading-Dye，收集粘冻样细胞裂解物入离心管中。将标本组织剪切成碎片，用PBS洗涤3次后放入匀浆器中，每50mg加入0.5mlLoading-Dye，彻底匀浆后收集裂解物入离心管中，12000g离心30min，保留上清蛋白样品，并将其转入另一离心管中。将上述培养细胞和标本组织的裂解物置于液氮中10s后取出，室温自然融解，用滴管吹打数次，置-20℃保存。1.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及电转移取出上述蛋白样品和蛋白Marker，置100℃水浴中5min。灌制分离胶和积层胶，用微量加样器分别吸取样品及蛋白质Marker各25μl，加入加样孔中。接通电源，取电压50V，电泳约2h。把滤纸、凝胶、硝酸纤维素薄膜（NC）按规定顺序放好，妥善固定后在转移缓冲液中进行电转移。1.4免疫学检测将每个泳道的NC切成宽约0.4cm的细条，丽春红染色检查蛋白质电转移效果，PBS清洗干净。将NC条放入封闭缓冲液中封闭12h。用抗MAGE-1蛋白单克隆抗体77B（瑞士Basal大学Spagnoli博士惠赠）的稀释液浸泡NC条，室温放置1h。将NC条清洗3次后浸入二抗稀释液中，室温放置1h。清洗后加入显色底物（BCIP/NBT），室温作用10-15min，清洗后观察显色结果。1.5统计学处理采用X2检验。2结果2.1MAGE-1蛋白在NSCLC中的表达MAGE-1蛋白的分子量为46Kda；3种人肺癌细胞系均表达MAGE-1蛋白；56例NSCLC标本中，25例表达MAGE-1蛋白，阳性率44.6%，而相邻正常肺组织均不表达；抗MAGE-1蛋白单抗77B还能...