耐吉非替尼的肺癌细胞株的建立及其耐药机制研究[摘要]目的：探讨耐吉非替尼的肺癌细胞珠的建立及其耐药机制研究。方法：本次研究取吉非替尼加入到人肺癌细胞系PC9培养条件中培养直至耐药情况产生，回顾相关特点及耐药机制。结果：应用0.5μmol·L-1吉非替尼向普通PC9细胞的培养基中持续加入，行3个月的培养后，再加入吉非替尼不再引起细胞死亡，获得耐药的细胞株（PC9-IR）。用同等浓度的吉非替层对敏感和耐药的细胞行72h处理，在5μmol·L-1下具体PC9-IR对吉非替尼仍缺乏一定敏感性，而在吉非替尼具体浓度在0.5μmol·L-1时，显著抑制了敏感PC9细胞生长。耐药细胞0.5μmol·L-1生长率为98%，敏感细胞为35%，差异有统计学意义（P<0.05）。异鼠李素（美国ChromaDex公司）对PBMNCs细胞和PC9细胞增殖作用显示，100μmol·L-1浓度下第1d的生长率为39%，远低于5μmol·L-1第1d86%的生长率，差异有统计学意义（P<0.05）。于6个孔板中接种PC9-IR，每孔存在100个细胞，健康志愿者培养应用正常培养基，试验组选择异鼠李素40μmol·L-1加入，培养10d，共重复3次，可见异鼠李素明显抑制PC9-IR细胞的克隆形成能力，有明显差异性（P<0.05）。结论：通过建立耐吉非替尼的肺癌细胞株，对其耐药机制进行分析，并选择PI3K-AKt类药物治疗，可显著改善预后，提高患者生存质量。关键词：吉非替尼；肺癌；细胞株；耐药机制临床肿瘤常见类型中，肺癌占有较高发生比例，其中以非小细胞肺癌最为多见[1]。吉非替尼为治疗晚期肺癌的药物，是一种酪氨酸激酶（表皮生长因子受体，ECFR）选择性抑制药[2]。但药物使用过程中有耐药情况存在，寻找耐药后联合用药及替代用药方案，是临床重点关注的问题，本次研究取吉非替尼加入到人肺癌细胞系PC9培养条件中培养直至耐药情况产生，回顾肺癌细胞株的建立及其耐药机制，现将相关内容报告如下。1资料与方法1．1一般资料常规准备人肺癌细胞系PC9，10%胎牛血清培养剂，达尔伯希必需基本培养基。取二甲亚砜（DMEM）配制储备液（10mmol·L-1），工作浓度采用DMEM配制，为10μmol·L-1，异鼠李素用DMSO配制成20mmol·L-1。1．2方法首先行药物诱导细胞耐药，用浓度为超过半数致死量的吉非替尼（0.5μmol·L-1）购自英国TORICS公司，对原始的PC9细胞进行处理，液体每3日更换1次，并取相同浓度的吉非替尼在换液时继续加入，选择磷酸盐缓冲液仔细清洗悬浮的死亡细胞，实施持续培养操作直至细胞出现无药物性死亡。充分检测细胞增殖情况，将细胞以每孔5×103接种在孔板上，孔板共96个，放置二氧化碳培养箱中培养，调整箱温度为37。C，设定实验时间，给予噻唑蓝（MTT）溶液购自美国CST公司，加入行4h孵育，将含MTT的培养基弃去，每孔给予DMSO各100μL加入，在摇床上放置并振荡，使结晶完全溶解，对吸光度（A）值在490nm波长处测量，每个浓度梯度设置5个复孔，共行3次试验。行克隆分析，细胞消化后采取计数板计数，于6孔板上接种，细胞在每孔为100个，采用培养基培养，培养液每3d换一次，行10d培养后，用4%多聚甲醛固定后将细胞结晶紫色，于倒置显微镜下加以观察，>30个细胞行一个克隆。行蛋白质印迹检测，用NP-40lysisbuffer制备蛋白样品，冰上行10min裂解后于温度为4。C下行10min离心，蛋白浓度采用BCA法测定，制备10%的SDS-PAGE凝胶并点样。孵育后行电化学发光检测，并应CELL成像仪对图像进行获取。分离并培养外周血单个核细胞（PBMNCs）。具体方法为5ml健康志愿者（对照组）的肝素化静脉血，离心，用60%密度将得到的细胞于培养板上种植，并用培养机完成培养操作。1．3统计学分析统计学软件采用SPSS13.0版，计量资料行t检验，计数资料行X2检验，P<0.05差异有统计学意义。2结果应用0.5μmol·L-1吉非替尼向普通PC9细胞的培养基中持续加入，行3个月的培养后，再加入吉非替尼不再引起细胞死亡，获得耐药的细胞株（PC9-IR）。用同等浓度的吉非替层对敏感和耐药的细胞行72h处理，在5μmol·L-1下具体PC9-IR对吉非替尼仍缺乏一定敏感性，而在吉非替尼具体浓度在0.5μmol·L-1时，显著抑制了敏感PC9细胞生长。耐药细胞0.5μmol·L-1生长率为98%，敏感细胞为35%，差异有统计学意义（P<0.05...