抗人132微球蛋白单克隆抗体的制备及鉴足［摘要］目的:制备抗人B2微球蛋白(32-microglobulin,02-MG)单克隆抗体并对其进行鉴定。方法：用高纯度的P2-MG免疫BALB/C小鼠，按常规技术制备针对B2-MG不同抗原表位的单克隆抗体，并对其进行纯化，测定抗体亚类、抗原表位分析等。结果：筛选出10株抗人P2-MG杂交瘤细胞株，EIJSA间接法证实这组单克隆抗体仅与B2微球蛋白反应，而与其他蛋白无交叉反应，IgG亚类鉴定6株为IgGl,2株为IgG2a,1株为IgA,1株为IgM。结论：获得特异性的抗人B2微球蛋白单克隆抗体，为试剂盒的开发研究奠定基础。［关键词］B2微球蛋白；单克隆抗体；制备；鉴定［中图分类号］R392.1［文献标识码］B［文章编号11673-7210(2008)06(a)-036-02ProductionandidentificationofmonoclonalantibodiesagainstP2-microglobulinDUHui-fen,LIKe~sheng,LIANXiao-wen,YUANMing,YEWen~hua(MedicalBiotechnologyCenter,GansuMedicalResearchInstitute,Lanzhou730050,China)［Abstract］Objective:Toprepareandidentify【nonoclonalantibodies(McAb)againstP2-microglobulin.Methods:Balb/cmicewereinjectedwithrecombinantP2-microglobulin,andthefiItrationandidentificationofthemAhagainsttheP2-microglobulinwasperformedusingindirectenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).Results:TenstrainsofhybridomaswereobtainedthatproducedtheinAbspecifictotheP2-microglobulinwithoutdetectablecross-reactivitywithotherpathogens.Ofthe10strains,6wereidentifiodastheiimnunoglobulinG1(IgGl)isotype,2asTgG2a，且ndtheotherasTgG2b.Conelusion:Thesespecificagainstthe32-microglobulinmayprovideabasisoffurtherresearchesonthepathogensis,proteinology,andearlydiagnosis.［Keywords］02-microglobulin;Monoclonalantibodies;Preparation;IdentificationB2微球蛋白(32-MG)［1］是由100个氨基酸组成的单链多肽，分了量为11.8kD,存在于除红细胞和胎盘滋养层细胞以外的所冇冇核细胞中，尤其在淋巴细胞和单核细胞存在丰富，在其免疫应答中起重要作用。已报道的测定32-MG的方法有多种，包括放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、时间分辨荧光免疫分析法、免疫透射比浊法、胶乳免疫散射比浊法等，其中有的测定方法检测灵敏度低，检测方法繁琐，需要专门的仪器设备，本研究采用简单、快速、有效的免疫方法，获得了高效价、特异性的抗人B2-MG单克隆抗体，为金标试剂盒的开发研究奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1B2-MG抗原02-MG抗原购白Sigma公司。1.1.2动物与试剂Balb/c小鼠(8~10周龄，雌性)由甘肃省医科院实验动物中心提供；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞购H中科院细胞库；弗氏佐剂、聚乙二醇(PEG)、次黄嚓吟、胸腺喘旋、氨基蝶吟均为Sigma产品；优质胎牛血清为中美合资兰州民海生物T程有限公司产品；DMEM培养基为Gibco产品。1.2动物免疫首先用卡介苗致敏小鼠，1周后将P2-MG与弗氏完全佐剂等量混匀，按10ug/只免疫小鼠，初次免疫后每间隔3周再免疫2次,抗原量翻倍加不完全佐剂等量混匀，在小鼠颈背部皮下分次多点注射免疫小鼠，细胞融合前3d腹腔加强免疫1次。1.3细胞融合及筛选[2~3]取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按81混合于融合管内，1000转/min离心10min,弃去上清，振荡细胞，使两种细胞尽量混合均匀，然后缓慢滴加预热的50%PEG溶液,再缓慢加入无血清的DMEM培养基以终止融合，静置后再以1000转/min离心10min,弃上清后加入HAT培养基，使细胞悬浮并混匀，加入适量饲养细胞，分散于96孔培养板在37°C、5%C02及饱和湿度下培养，第6天换液，第10天开始检测筛选。两周后可换为HT培养基，待克隆孔长至1/3〜1/2时，取培养上清液进行抗体检测，用间接法筛选阳性孔。将阳性孔丿IJ有限稀释法进行3次亚克隆，建株的杂交瘤细胞再扩大培养、冻存和制备腹腔积液。1.4腹腔积液制备和纯化正常Balb/c小鼠于1周前腹腔注射0.5ml液体石蜡进行预处理，再将制备好的杂交瘤细胞注射于预处理过的小鼠,2X106/只,约10d后收集腹腔积液,经50%、45%硫酸谖盐析沉淀和SephareyS-300凝胶柱分离纯化。1.5间...