人骨形成蛋白-7成熟肽cDNA的克隆和序列测定关键词：骨形成蛋白-7；克隆；序列测定中号：Q786文献标识码：B文章编号：1007－8738(2000)03－0213－02▲人骨形成蛋白?7(hBMP?7)最早由Celeste等〔1〕克隆并命名。同年，Ozkaynat等〔2〕从人脑cDNA文库中也筛选出此克隆。以后研究表明，BMP?7除了诱导成骨外，还具有广泛的生物学活性〔3－6〕。由于hBMP?7在神经系统及造血组织中的特殊作用，故其在基础研究和临床应用中具有广阔的前景。我们采用自行设计合成的一对特异性引物，以骨肉瘤的λgt11噬菌体表达文库为模板，通过PCR扩增到hBMP?7成熟肽的cDNA。将其克隆入载体pGEM?3zf(?)，所获序列与已发表的序列完全一致，为进一步对其表达和功能研究创造了条件。1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析1:PCRmarker(从上至下为：1543，994，697，515，377和237bp)；2：PCR产物.2重组质粒pGEB7的酶切鉴定1：PCRmarker(从上至下为：1543，994，697，515，377和237bp)；2：重组质粒pGEB7的EcoRI＋HindIII双酶切.1材料和方法1.1材料大肠杆菌DH5α及质粒pGEM?3zf(-)均为本室保存。骨肉瘤细胞U2-OS的λgt11噬菌体表达文库为本室构建。各种限制性内切酶、连接酶和Taq酶均为Gibco公司的产品。AdvantagePCR-purekit为Clontech公司产品。常用试剂为进口分装或国产分析纯。PCR扩增引物自行设计，由上海生物工程中心合成。引物的序列如下：P1：5′TTTAAATGTCCACGGGGAGCAAAC3′;P2：5′GCGTCGACTTAGTGGCAGCCACAG3′.1.2方法1.2.1hBMP?7成熟肽基因的扩增PCR反应体系：P1和P2引物(20mmol/L)各1μL，dNTP(10mmol/L)1μL，模板λgt11噬菌体3μL，10×PCRbuffer5μL和Taq酶1U，加水至总体积50μL。PCR反应条件：94℃30s，50℃30s，72℃30s反应5个循环。然后，于94℃30s，55℃30s，72℃30s，反应30个循环。PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.2重组质粒的构建用HincII酶切载体pGEM?3zf(-)并回收，同时回收PCR产物，用T4连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆。1.2.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪进行。2结果2.1hBMP-7成熟肽基因的扩增以λgt11噬菌体表达文库为模板，利用自行设计的一对引物，进行PCR扩增hBMP-7成熟肽基因。经两段反应共35个循环后，用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得约440bp的特异条带，与预期的大小相一致(1)。2.2重组质粒的构建回收440bp片段，在T4连接酶作用下，与用HincII酶切的质粒pGEM?3zf(-)于16℃连接过夜。以连接产物转化感受态细胞DH5α，加入IPTG和X-gal进行蓝白筛选。随机挑取白色克隆，提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切。经15g/L琼脂糖凝胶鉴定表明，切出440bp片段者为阳性克隆(2)，将此重组质粒命名为pGEB7。2.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪测定hBMP?7成熟肽基因的序列，所得结果与已发表的序列完全一致(3)。TCCACGGGGAGCAAACAGCGCAGCCAGAACCGCTCCAAGACGCCCAAGAACCAGGAAGCC(60)CTGCGGATGGCCAACGTGGCAGAGAACAGCAGCAGCGACCAGAGGCAGGCCTGTAAGAAG(120)CACGAGCTGTATGTCAGCTTCCGAGACCTGGGCTGGCAGGACTGGATCATCGCGCCTGAA(180)GGCTACGCCGCCTACTACTGTGAGGGGGAGTGTGCCTTCCCTCTGAACTCCTACATGAAC(240)GCCACCAACCACGCCATCGTGCAGACGCTGGTCCACTTCATCAACCCGCAAACGGTGCCC(300)AAGCCCTGCTGTGCGCCCACGCAGCTCAATGCCATCTCCGTCCTCTACTTCGATGACAGC(360)TCCAACGTCATCCTGAAGAAATACAGAAACATGGTGGTCCGGGCCTGTGGCTGCCACTAG(420)3BMP?7成熟肽编码基因的部分核苷酸序列3讨论hBMP-7具有广泛的生物学活性：①胚胎发育中所产生的BMP-7和BMP-4是诱导交感神经元分化的信号分子。②能抑制胚胎癌性细胞(ECC)的增殖，诱导其分化，可能对一些干细胞肿瘤有治疗价值。③对牙齿的修复、形成有重要作用。④对鼠胚胎菱脑的发育和形成有一定影响，为哺乳动物眼部发育所必需〔5〕。剔除(knock?out)该基因的小鼠出生不久即死于肾脏发育不良，提示其可能与小儿肾功能不良所致贫血和骨骼发育不良有关，从而使其在基础研究和临床应用等方面具有比较重要的价值。但天然来源的BMP-7较少，限制了对其功能的研究。国外多用真核表达系统表达BMP-7，只有极少数人尝试用原核表达系统进行表达研究...