水飞蓟宾抑制缺氧状态下胃癌细胞系MGC803增殖的分子机制DOI：10.16662/jki.1674-0742.2016.11.009[摘要]目的探讨水飞蓟宾抑制缺氧状态下胃癌细胞MGC803细胞的生长增殖的分子机制。方法体外缺氧条件下体外培养胃癌细胞系MGC803，用不同浓度水飞蓟宾处理后，采用MTT检测水飞蓟宾对MGC803细胞增殖的影响，Westernblot检测Akt的磷酸化。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血管内皮生长因子（VEGF）的分泌情况。结果0～250μmol/L蓟宾可显著抑制胃癌细胞MGC803增殖，但0～100μmol/L水飞蓟宾对Akt磷酸化以及VEGF分泌无明显影响，而250μmol/L水飞蓟宾可诱导MGC803细胞磷酸化并抑制VEGF分泌。结论水飞蓟宾可能通过影响PI3K/Akt磷酸化以及VEGF的分泌而发挥抗肿瘤活性。[关键词]水飞蓟宾；胃癌；血管内皮生长因子[]Q3[文献标识码]A[]1674-0742（2016）04（b）-0009-03胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。尽管早期根治性手术是胃癌最有效的治疗方法，但对于转移患者而言，化疗依然发挥重要的作用[1]。随着对胃癌分子生物学研究的深入，目前通过对其生长增殖的相关信号转导通路进行干预，是近年研究的热点。研究表明，某些中医药在治疗肿瘤方面具有广泛的应用前景[2-3]。水飞蓟宾（Silibinin）是从菊科药用植物水飞蓟种子的种皮中提取出来的一种黄酮类化合物，临床上常用来治疗一些肝脏疾病[4-5]。水飞蓟宾毒性低。体外研究以及动物实验研究显示水飞蓟宾对多种肿瘤细胞具有较强的拮抗以及化学预防效应，并能影响多重信号通路的激活[6-7]。然而，水飞蓟宾是否也能通过影响缺氧状态下胃癌细胞增殖的机制目前尚不清楚。该研究旨在初步观察水飞蓟宾对胃癌细胞系MGC803增殖的影响及其分子机制，现报道如下。1资料与方法1.1一般资料DMEM培养基和胎牛血清购自Hyclone（Invitrogen，USA），水飞蓟宾（纯度98%）、抗磷酸化以及抗total-Akt购自CellSignaling（Beverly，MA）。蛋白酶抑制剂购自Roche（Mannheim，Germany），细胞总蛋白提取试剂盒购自Novagen（Gibbstown，NJ），血管内皮生长因子（VEGF）ELISA检测试剂盒购自美国Pierce（IL，USA）。1.2细胞培养与处理人胃癌细胞系MGC803（ATCC）用含10%胎牛血清（Invitrogen，USA）、1%青霉素和链霉素（St.Louis，MO）的DMEM培养基中，于37℃，5%CO2浓度下培养。待培养的细胞密度达到1×106时调整血清浓度为3%，随后将培养板置于O2调节器中（COYLabs），根据氧浓度测定仪上显示值，调整充入气体气流量，最终使CO2和N2的比例分别为5%和95%，供不同的实验目的使用。1.3Westernblot收集经水飞蓟宾处理后的各组细胞，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液（25mmol/L；Tris-HCl；pH7.4，150mmol/LNaCl，1%NP-40，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS）裂解细胞。将获得的总蛋白用Bradford法于595nm波长处测定其浓度后，取20μg蛋白用于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，并于室温下用5%脱脂牛奶封闭2h。随后分别孵育一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗，ECL发光、显影。1.4血管内皮生长因子检测把MGC803细胞接种至96孔板中，待其密度生长至80%～90%视野时，弃培养基，并加入不同浓度的水飞蓟宾作用相应时间。根据试剂盒提供的操作步骤，12h后测量分泌至细胞外的血管内皮生长因子含量。VEGF按照试剂盒提供的双抗体夹心法进行。加入显色剂显色后，没孔加入1滴终止液，于450nm波长处在酶标仪下获得其吸光度值，并根据绘制的标准曲线计算其浓度。1.5细胞增殖活性分析采用MTT法检测细胞的增殖活性。将生长旺盛的MGC803细胞接种于96孔板中（100μL），培养12h后更换为无血清培养基，随后加入0～500μmol/L的水飞蓟宾孵育72h。终止培养前4h每孔加入MTT溶液20μL，轻微振荡以充分混匀培养液后，加入200μL二甲基亚砜，快速振荡30s后，用酶标仪（设置波长为570nm）测定各孔的吸光度值，并计算抑制率，计算公式：实验组吸光度/对照组吸光度×100%。1.6统计方法应用GraphPadPrizm6.0软件进行统计学分析，计量资料用（x±s）表示，并采用单因素方差分析数据，P<0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1水飞蓟宾抑制MGC803细胞增殖MTT结果显示，0～50μmol/L水飞...