一株产黑色素海洋细菌的初步鉴定摘要：从波罗的海近海海水屮分离出1株产黑色素的海洋细菌。该菌株可利用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖等碳源，H2S、V.P.及明胶液化试验呈阴性，酶触试验呈阳性，为革兰氏阴性细菌，经16SrDNA初步鉴定后命名为Rheinheimerasp.09BSZB-9,并对其产生的黑色素作了初步研究。关键词：海洋细菌；黑色素；鉴定；Rheinheimera中图分类号：Q93-3文献标识码：A文章编号：0439-8114(2013)13-3046-03黑色素广泛存在于自然界生物体内，是一类由L-多巴、酪氨酸和半胱氨酸氧化或聚合而成的天然或合成色素［1］。它是医药、农业及化妆品行业的一种生产原料。从动植物体内提取黑色素的生产过程繁琐、成本高，而微生物所产的黑色素一般是由胞内酶催化形成的氨基酸的衍生物。产黑色素的微生物资源丰富，生产工艺简单易行，产品无毒害，稳定性好。因此研究微生物发酵产生黑色素具有很大的优势［2-4］o人们对陆境产黑色素的微生物研究较多，对海洋中产黑色素的微生物报道较少。本试验研究从波罗的海分离的一株着色菌科细菌，该菌具有产黑色素的能力，在牛理生化特征及16SrDNA序列等方面与Rheinheimerachironomi相近，以期为海洋微生物黑色素研发提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种來源菌株ZB-9由本实验室的刘斌分离于波罗的海(E12.6875°,N54.4298°)海水。1.1.2主要试剂和仪器DNAMarker>dNTPs、Taq酶等购gTakara公司;PCR纯化试剂盒购自Omega公司;Biometre公司PCR扩增仪(T3)；Eppendorf公司微型台式离心机；H本JEOL公司JEM-1230透射式电镜；德国Bruker公司TENSOR27型红外光谱仪。1.1.3培养基2216E细菌培养基、Tyr发酵培养基［5］、酪素培养基［6］、LB培养基均按人工海水和蒸憾水各半配制，121°C灭菌30mine1.2方法1.2.1生理生化指标的测定参照文献［7、8］对菌株ZB-9进行生理生化实验测定。1.2.2形态特征观察及发酵将菌株ZB-9接种于LB培养基，24°C培养2d,利用显微镜及透射电镜观察菌体形态并拍照。将菌株涂布于2216E平板24°C活化2d,转接试管培养2d,再将菌液接种于1.1.3的4种液体培养基中，24°C,150r/min摇瓶培养至菌液呈黑色。1.2.316SrDNA序列分析细菌基因组DNA的提取参照文献［9］的方法。PCR扩增的通用引物：27F,1492R；PCR反应条件：95°C5min,94°C40s,56°C40s,72°C2min,30个循坏；72°C10min0PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒纯化后，送交上海博亚生物技术有限公司完成序列测定。所测得的序列提交至GenBank,获得登录号，并与数据库EzTaxonServerVersion2.1中已有序列进行BLAST比对分析，选取同源性较高的16SrDNA序列作为参比对象，运用DNAMAN进行多重序列分析,通过MEGA4.0软件，采用邻接法构建系统进化树［10］o1.2.4黑色素的提取与鉴定参照文献［11、12］方法提取黑色素；取少量提取的黑色素纯品，用澳化钾压片法测其红外吸收光谱。2结果与分析2.1菌株的生理生化特征挑新鲜菌落于3%的K01I中出现拉丝现象，为革兰氏阴性菌，I12S、V.P.及明胶液化试验呈阴性，酶触试验呈阳性，铜离子（0.1g/L）会抑制英生长。对麦芽糖、蔗糖及纤维二糖利用较好，不能利用淀粉、柠檬酸（表l）o菌株在酪氨酸培养基上适宜生长温度为4〜40°Co菌落较小，湿润、光滑、圆形突起、边缘整齐，菌体Z间粘连成团，易挑取整个菌落，呈黑色（起初白色，产黑色素后呈黑色，图1）。2.2菌株的形态及发酵特性菌体宽0.8-1.4Pm,长0.8-2.4um,电镜下菌体周围有分泌物,单端鞭毛（图2）。菌株在4种液体培养基中均产生黑色素，其中较好的是Tyr发酵培养基。2.3菌株的鉴定结果该菌株的16SrDNA序列长度为1358bp,GenBank登录号为HM566014。将该序列与数据库EzTaxonServerVersion2.1相关序列进彳亍BLAST分析，选取同源性高的9株菌的16SrDNA序列构建系统发育树，如图3所示，该菌株与R・chironomi处于进化树的同一分支，同源性99.853%,与R.pacifica的同源性97.035%。除产黑色素同R.chironomi有别外，其他生理生化及形态特征差别不大。2.4黑色索的鉴定结果红外光谱分析表明，样品在3300-3400cm-1、1640cm-1附近有强吸收峰，在1382cm-l、1450〜1600cm-l>2900cm-1附近冇弱吸收峰；1238cm-1附近有中强吸收峰...