原花青素对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠海马组织nNOS的影响【摘要】目的探讨原花青素（procyanidin,PC）对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠脑组织中神经元型一氧化氮合酶（nNOS）表达的影响。方法将66只大鼠随机分为假手术组、2型糖尿病单纯脑缺血组及PC组（100mg/kg），分别于术后3、6、12、24、48h应用免疫组织化学方法行nNOS半定量分析。结果脑缺血后海马区有大量nNOS免疫反应阳性细胞表达，缺血后3h开始表达，6h达高峰，12h后逐渐降低；在相同的时间点，模型组较假手术组明显升高(P《0.01)，PC组较模型组明显降低(P《0.01)，与假手术组无明显差异(P》0.05)。结论PC具有降低2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠脑缺血海马组织nNOS活性的作用。【关键词】糖尿病脑缺血原花青素神经元型一氧化氮合酶糖尿病是脑血管病的一个重要危险因素，高血糖可以引起或加重缺血性脑损害。目前虽已有多种药物用于临床，但疗效均不理想。缺血性脑损伤是由多种致病因素共同参与，共同促进的结果，其中氧自由基损伤是其最重要的且肯定的因素。原花青素（procyanidin,PC）是一种很好的氧自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂[1]，对大鼠血清和脑组织的脂质过氧化物的形成有明显的抑制作用。我们拟从神经元型一氧化氮合酶（nNOS）的角度来探讨PC对2型糖尿病大鼠局灶性脑缺血的神经保护机制，为其临床应用提供理论依据。1材料与方法1.1实验动物选用健康雄性SD大鼠66只，体重180～240g(辽宁医学院实验动物中心提供)，许可证号：SCXK（辽）。实验动物级别：普通级。1.2实验分组66只大鼠随机分为假手术组（6只）、模型组（30只）、原花青素组（PC组，30只），PC组在建立2型糖尿病模型后给予灌胃，1次/24小时，连续1w，于大脑中动脉闭塞（MCAO）术前1h再灌胃1次。PC组以PC粉剂100mg/kg，每次蒸馏水配制成悬浮液灌胃，其他各组组以相同的给药方法给予生理盐水(NS)1mL·kg-1。1.32型糖尿病大鼠局灶性脑缺血模型的制备每笼5只，常规饲料适应性饲养1w，然后喂饲高脂高糖饲料（10%猪油，2.5%胆固醇，1.0%猪胆酸盐，20.0%蔗糖，66.5%常规饲料[2]）。4w后，诱导出高胰岛素血症和胰岛素抵抗，按25mg/kg体重的剂量1次性尾静脉注射STZ溶液（临用前以0.1mol·L-1pH值4.2的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制成0.5%的溶液[3]）。72h后取尾血测血糖，超过16.7mmol·L-1为2型糖尿病大鼠[4]。2型糖尿病大鼠造模成功后2w后按照文献[5]进行大鼠局灶性脑缺血模型（middlecerebralartery---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---occlusion，MCAO）的制作。栓线鼠即刻出现左侧Horner征或麻醉苏醒时出现右侧前肢内收屈曲或爬行时向右侧划圈或倾倒为造模成功，有代表性标本观察结果并记录)。1.4免疫组化法检测缺血侧大脑海马CA1区nNOS的表达造模后24h，大鼠以10%水合氯醛3mL·kg-1腹腔注射麻醉后固定，颈正中偏右切口，暴露右颈总动脉，用NS约50mL灌注，然后用4℃4％多聚甲醛液约50mL灌注固定，分别于各时间点断头取脑，取双侧大脑冠状位距嗅球尖端6～11mm的脑组织块，放入4%多聚甲醛固定液中继续固定24h，常规梯度脱水、透明、石蜡包埋。从冠状面中1/3层面开始留取切片，厚度5cm，连续切片，切片贴附于经APES处理的载玻片上，备用。用免疫组化法测定。严格按试剂盒说明书进行操作。观察大鼠海马CA1区，每张取4个视野数用图像用分析仪计算nNOS阳性细胞数，取其平均值。1.5统计学处理实验数据用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析和q检验。2结果原花青素对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠海马组织CA1区nNOS表达的影响在脑缺血后海马区可见大量nNOS免疫阳性细胞表达，在脑缺血后的相同时间点，3h时出现表达，到6h时达高峰，12h开始降低。在缺血后相同时间点，模型组组均较假手术组表达明显升高（P《0.01）；在缺血后相同时间点，PC组较对照组表达均明显降低（P《0.01），与假手术组相比无明显差异（P》0.05,见表1）。表1PC对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠大脑海马注：与假手术组相比较，▲▲P《0.01；与模型组比较，★★P《0.013讨论糖尿病是脑梗死的的独立危险因素，血糖升高不但作为重要的危险因...