卵黄免疫球蛋白的分离提取与鉴定宋宏新高栋薛海燕(陕西科技大学生命科学与工程学院咸阳-712081)摘要：对氯仿法、辛酸法、水稀释法、水-辛酸法分离卵黄免疫球蛋白(IgY)进行了比较，结果表明:水-辛酸法在9倍稀释度、pH5.3、辛酸加量1%条件下，可获得较好效果，进一步用硫酸鞍沉淀脱盐后，提取率达93.4%,产率达4.67mg/mL卵黄，纯度达85%。关键词：卵黄免疫球蛋白；水-辛酸法；提取；鉴定中图分类号：TS201.2文献标识码：A文章编号：1005-9989(2003)05-0099-03ExtractionandIdentificationofImmunoglobulinofYolkSONGHong-xinGAODongXUEHai-yan(LifeScience&EngineeringCollege,ShanxiUniversityofScienceandTechnology,Xianyang,712081)Abstract：ThisstudywasacomparisonofreportedmethodsofextractionofIgYfromheneggyolk.Fourmethodsolipidremovalwerecompared,followedbyamethodofimmunoglobulinprecipitation.Theresultsshowedthatthemethodofwater-caprylicacidwasthebestone,theextractionratioofIgYwas93.4%,andtheyieldwas4.67mg/mLyolk,thepuritywas85%・Keywords：IgY;water-caprylicacid;extraction;identification0前言目前，抗体在疾病的治疗、诊断及医药食品的检验中被广泛地使用。寻找一种经济、快速、高效的生产提取方法，有着广阔的前景。卵黄免疫球蛋白就是卵黄中的Y-卵黄球蛋白，由于其蛋白质的物理化学性质、免疫学性质等方面与哺乳动物IgG存在一定差异，所以在免疫学领域把由鸡卵黄中获得的抗体称为卵黄免疫球蛋白(ImmunoglobulinofYolk,以下简称IgY),IgY的应用主要在于疾病的诊断检测和防治⑴、曽医临床⑵、食品添加剂⑵及化妆品领域⑶等。1材料与方法1.1主要试剂法氏曩病毒(IBDV)中等毒力活疫苗：中牧股份南京药械厂；IBDV琼扩抗原：中国兽药监察所；标准鸡抗体：鼎国生物产品发展中心；兔抗鸡IgG抗血清：鼎国生物产品发展中心；IBDV阳性血清：中国兽药监察所。1.2高免鸡蛋的制备收稿日期：2002-12-30作者简介：宋宏新(1959-),男，教授.主要从事生物化学与分子生物学、食品科学方面的教学和科研工作。首免采用饮水免疫法，IBDV弱毒苗用5倍剂量；10d后2免，弱毒苗10倍剂量，再加上油乳剂灭活苗进行肌肉注射；再过10d进行3免，方法同2免，只是弱毒苗用量增为20倍剂量；然后再根据具体效价变化进行第4次免疫。1.3IgY的分离131氯仿抽提法⑷取卵黄原液，加入0.8%PBS溶液稀释，用漩涡混合仪混合均匀至无明显大块卵黄液。在搅拌的情况下缓慢加入氯仿，混匀后静置，4°C过夜。4000r/min离心20min,上层水相即为所要分离的IgY初提液。1.3.2辛酸法⑸取卵黄原液，加入0.8%PBS溶液稀释，用漩涡混合仪混合均质，加入正辛酸使终浓度为1%,静置。4500r/min下离心20mino离心后分成4层，抽取第3层清液，即为IgY初提液。1.3.3水稀释法(WD法)⑹取一定体积的卵黄原液，加9倍于卵黄原液体积的蒸憾水，泯匀。用稀酸调pH至5.3,静置。8000r/min下离心30min,上清液即含有所要分离的水溶性IgYc134水-辛酸法于水稀释法所制得的上清液中缓慢加入1%的正辛酸，搅拌10min,放入冰箱冷冻食品科技■营养研究1094-2013ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse・Allrightsreserved.lOmin,抽滤得IgY初提液。1.4IgY的提取硫酸钱沉淀法⑺。分别调节50%饱和硫酸钱溶滋和上述方法得到的IgY初提液至pH5.3o在IgY初提液中缓慢加入相同体积的50%硫酸锁溶液，4°C迥夜。离心弃去上清液后，用0.8%PBS重新悬浮沉淀至初体积，再在搅拌下加入初体积一半的33%的铉和硫酸钱溶液，静置lho再次离心，弃去上清液。用0.8%PBS重悬沉淀，得IgY溶液。1.5指标测定【8切脂肪测定：氯仿■甲醉法；蛋H质含量测定：Bradford法；IgY含量测定：单向琼脂扩散法；效价测定：双向琼脂扩散法；活性及纯度：免疫电泳法。2结果与讨论2.1琼扩结果图如图1、图2所示。中间孔点抗原，图1为免疫后第15d的卵黄琼扩结果，其中最上孔点标准阳性血清作对照，其余孔点不同稀释度的卵黄稀释液（顺时针分别为：1：1、1：2、1：4、1：8、1：16）o图2为第60d的卵黄琼扩结果,逆时针为1：4~1：128稀释度的卵黄稀释液，所形成的实线即为免疫沉淀线。...