鼠胚胎成纤维细胞三维培养修复大鼠全层皮肤缺损的效果及其机制［摘要］目的观察鼠胚胎成纤维细胞三维培养修复大鼠全层皮肤缺损的效果，并对其机制进行分析。方法采用组织块法培养鼠胚胎成纤维细胞，将藏尾胶原溶液和以血清重悬的鼠胚胎成纤维细胞溶液混合后形成凝胶构建组织工程皮肤，移植于大鼠背部全层皮肤缺损创面。实验组30只全层皮肤缺损大鼠采用组织工程皮肤进行修复。对照组30只全层皮肤缺损大鼠不做任何处理。两组创面分别进行HE染色和免疫组织化学染色，计算微血管密度，观察其愈合过程。结果术后20d实验组用组织工程皮肤覆盖的大鼠背部创面已完全愈合，新生上皮外观与结构和正常皮肤相似；对照组创面仍有痂皮覆盖，去除痂皮可见肉芽组织红润致密，创面周围新生上皮呈粉红色，边缘锐利皱缩。实验组创面组织中CD31表达及微血管密度均明显高于对照组，差异有统计学意义（P［关键词］胚胎成纤维细胞；三维培养；皮肤缺损;微血管密度［中图分类号］R641［文献标识码］A［文章编号］1674-4721(2016)10(c)-0012-04[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectandmechanismofthreedimensionalcultureofratembryonicfibroblastsinthetreatmentoffull-thicknessskindefectinrats.MethodsFull-thicknessskinwoundwascreatedonthebackofrats.Tissueblockmethodwasusedtocultureratembryonicfibroblastcells.Theratembryonicfibroblastcellsresuspendedinserumweremixedwithtailcollagensolutiontostructuretissueengineeredskin.Intheexperimentalgroup，fullthicknessskindefectrats(n=30)weretransplantedwithtissueengineeredskininthewoundarea.Inthecontrolgroup，full-thicknessskindefectrats(n=30)werenotgivenanyspecialtreatment.ThemicrovasculardensitywascalculatedandthehealingprocesswasobservedbyHEstainingandimmunohistochemistrymethod.Results20dafteroperation,intheexperimentalgroupthewoundareastransplantedwithtissueengineeringskinonthebackofratwerecompletelyhealed；theappearancesandstructuresofnewbornepitheliumweresimilartothenormalskin.Thewoundsofthecontrolgroupdidnotshowhealingandwerecoveredwithscar；removingscabskinvisibledgranulationtissueswereruddyandcompact；therewerepinkwoundsaroundnewepithelium,andshrinkagearoundtissueedges.Intheexperimentalgroup,andtheexpressionofCD31andmicrovesseldensityinwoundtissuesweresignificantlyhigherthanthoseinthecontrolgroup（P1材料与方法1.1动物孕龄16〜19d的SD大鼠10只；雄性SD大鼠60只，5月龄，体重200〜250g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001o1.2主要仪器VD-1320洁净工作台（德国Hermle），3111CO2培养箱（美国Thermo），倒置生物显微镜（北京市半导体设备厂），培养皿，手术刀柄、刀片，巾钳，持针器，有齿镊，药杯，弯盘，缝合针，蚊式钳，消毒钳，剪刀，眼科剪，眼科镊，缝合线等。1.3主要试剂及药品DMEM培养基、胰蛋白酶、胶原酶、小牛血清，均购于美国GIBCO公司；人IL-6、TGF-31ELISA试剂盒，购于北京达科为生物技术有限公司；苏木精染色液、伊红染色液，购于广州市欣源贸易有限公司，批号分别为474077、C0109。1.4方法1.4.1成纤维细胞培养将10只处于妊娠16〜19d的大鼠处死，酒精浸泡消毒，无菌条件下分离胚胎，取鼠胚胎皮肤，用含双抗的PBS清洗2〜3次，将皮肤切成1-1.5mm2小块。用镊子将切好的组织块贴到培养瓶内，在CO2孵箱内孵育4h，加入少量培养基继续孵育24h，然后将培养基加至正常量，隔2d换1次液，当成纤维细胞达到60%〜70%，传代培养。1.4.2鼠尾胶原制备将上述处死的大鼠的尾部剪下，用75%乙醇浸泡消毒30min，在无菌条件下抽出肌腱，用生理盐水反复冲洗，剪碎，置于0.1%乙酸溶液中浸泡48h。4°C低温离心(10000r/min,30mim)后取上清。放置在4°C冰箱过夜，取出后用0.1mol/LNaOH调pH值，用100g/L氯化钠溶液反复盐析，离心(1000r/min,5min)弃上清。用0.1%的乙酸溶解，保存在4°C冰箱备用。1.4.3成纤维细胞胶原凝胶...