活体成像观察小细胞接种量LLC细胞小鼠皮下成瘤活体成像观察较少细胞数LLC细胞小鼠皮下成瘤连亨宁1,王丽婷2,肖贞良1•成都军区总医院呼吸内科四川成都6100832•第三军医大学生物医学分析测试中心重庆市404100关键词:中图分类号：R73-35+2来源于C57BL小鼠的Lewislungcarcinomacells（LLC小鼠肺腺癌细胞）己被广泛用于肺癌的相关研究。将肿瘤细胞中转入带有荧光标记的基因,利用小动物活体成像技术观察肿瘤细胞在动物体内生长、转移，具冇可重复进行、非侵入性的优点［1］。常用的荧光报告系统分为两种，以绿色荧光蛋白（GFP）为代表的自发荧光；以荧光素酶（Luc）为代表的生物发光,它需要激活外源性的荧光素而产生荧光。相对于自发荧光，生物发光报告系统荧光强度更高，背景信号更弱，因此观测的灵敏度更高，因此广泛用于临床前的药物筛选［2］。在使用LLC细胞构建小鼠肺腺癌模型吋，其皮下接种细胞量通常在5X105-1X106之间，最低使用细胞数为2X105⑶。本实验使用带有Luc荧光素酶报告基因的LLC细胞接种小鼠，接种细胞数量由低到高，动态观察小鼠肿瘤生长情况。1材料与方法：1.1材料：8周龄C57雌性小鼠3只、带冇Luc荧光素酶报告基因的LLC细胞系LL/2-IUC-M38（购自第三军医大学生物医学分析测试中心）、使用HBSS稀释0.2um滤膜过滤除菌的荧光素溶液(购自Biovision),以及细胞培养所需的1640培养基(完全培养基含10%胎牛血清、1%青链霉素、1%谷氨酰胺)、0.25%胰酶均为进口试剂。1.2实验仪器：流式细胞分析仪(BDVerse)>小动物活体成像仪(PerkinElmerIVIS)>以及细胞培养所需细胞孵箱(37°C、5%C02)o活体成像荧光素LLC细胞1.3流式细胞分析仪检测LLC细胞生长至80%细胞密度吋收获细胞，分别使用HBSS和150mg/L的荧光素溶液重悬细胞，进行流式检测，接受光波长设置为560nmo1.4小鼠皮下接种肿瘤细胞小鼠腋下接种细胞悬液50Ul,接种量由低到高分别为5X104>1X105>2X105o1.5活体成像检测体外实验96孔板中每孔加入5X104个细胞，共两个孔，分别使用HBSS缓冲液和150mg/L的荧光素溶液定容至100UI。体内实验小鼠腹腔注射15g/L的荧光素溶液200Ul,5分钟后活体成像观测。检测前小鼠剃毛，腹腔注射戊巴比妥钠溶液(15Ug/g体重)麻醉。2结果2.1体外实验验证LLC细胞的Luc报告系统效率流式细胞分析结果如图1A所示，加入荧光素底物后，81.4%的细胞为阳性，其中部分细胞呈强阳性。活体成像仪观测如图1B所示，加入荧光素底物后，可观测到明显的荧光。ALLC细胞流式细胞分析左图为未加如荧光素底物的对照，右图加入荧光素底物(D・luciferin)。B活体成像仪检测平板中的LLC细胞左孔为未加荧光素底物的对照，右孔加入荧光素底物。AflowcytometryresultofLLCcellwithabsenceorpreseneeofD-Luciferin•BLLCcellwithabseneeorpreseneeofD-Luciferinin96-wellplatesdectedbyInvivoimagingsystem.TheleftwellasacontrolwithoutD-luciferin.图1体外实验验证Luc报告基因效率。Fig1TheLucreportergeneefficiencyinvitroexperiment2.2皮下种植肿瘤生长情况观察小鼠按照不同的细胞浓度接种肿瘤后，在不同的时间段进行观测，如图2所示。接种后当天所冇接种部位均能检测到荧光，荧光强度与细胞接种数量呈正相关。接种后1周检测，所有接种部位均形成肉眼可见肿瘤,肿瘤大小以及荧光强度与接种细胞数量呈正相关。图2活体成像仪检测肿瘤生长情况Fig2Tumorgenerationinvivodetectedbytheinvivoimagesystem讨论：本实验采用低于常规剂量的细胞数接种，均能成瘤。研究者可根据实际条件选择接种的细胞数。带Luc报告基因的LLC细胞阳性率低于90%,但仍有较为理想敏感性。最小细胞量接种后，当日就能通过活体成像观测到，荧光强度与细胞接种数量成正相关。目前对于荧光素酶报告基因的优化在持续的开展。使用新的Luc2报告基因可以使荧光强度增加4倍，Jae-BeomKim等学者使用Luc2报告基因转染小鼠乳腺癌细胞4T1,小鼠腹腔接种后，使用活体成像仪观察，最低可分辨出5个细胞⑷。BrianA.Rabinovich等学者构建的effLuc报告基因可以使荧光强度提高100倍，转染T细胞后，最低可观测到皮下种植的3个细胞⑸。然而由于小鼠毛发、不均匀分布的皮肤色素沉着，会吸收部分...