痹祺胶囊水提取物促进成骨细胞MC3T3・E1增殖的作用张少卓1崔元璐1马晓君2冯其帅1王振寰3柳占彪1(通讯作者)(1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室■省部共建国家重点实验室培育基地天津300193)(2.天津同仁堂集团股份有限公司天津300203)(3.内蒙古农业大学内蒙古呼和浩特010018)【摘要】目的：研究痹祺胶囊水提取物对成骨细胞MC3T3-E1的作用及其机制。方法：(1)体外培养成骨细胞MC3T3-E1,分为对照组及痹祺胶囊水提取物(0.125,0.25,0.5,1,2,4g·L-l)干预组，48h后,MTT法检测细胞增殖情况(2)培养MC3T3-E1细胞，分为对照组及痹祺胶囊水提取物(0.25,0.5,lg·L-l)T预组,48h后,用RT-PCR检测骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA,骨钙素(OC)mRNA以及碱性磷酸酶(ALP)mRNA表达。结果:⑴痹祺胶囊水提取物各干预组MC3T3-E1细胞的OD值均明显升高，与对照组比较有统计学差异(P<0.01)o(2)痹祺胶囊水提取物0.5g·L-l组的BMP-2mRNA,ALPmRNA和OCmRNA表达均明显增强，痹祺胶囊水提取物0.25g·L-l组的ALPmRNA和痹祺胶囊水提取物1g·L-l组的OCmRNA表达也明显增强，与对照组比较均有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。结论痹祺胶囊水提取物可促进成骨细胞MC3T3-E1增殖，通过上调BMP-2mRNA,ALPmRNA和OCmRNA的表达，也可促进成骨细胞的分化功能。【关键词】痹祺胶囊水提取物骨钙素骨形成蛋白・2【中图分类号】R453【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2014)23-0226-02骨质疏松症属于中医“骨痹”的范畴，是一种以骨量减少、骨组织微结构退变、骨力学强度下降及骨折危险性增加为主要特征的骨代谢性疾病[1],目前尚无有效的治疗药物。因此，刺激成骨细胞增殖并促进其分化成熟，可为骨质疏松症的治疗提供思路和理论依据。本文就痹祺胶囊水提取物对体外培养小鼠成骨细胞MC3T3・E1增殖的影响及骨形态发生蛋白・2(bonemorphogeneticprotein,BMP-2)mRNA>骨钙素(osteocalcin,OC)mRNA以及碱性磷酸酶(alkalinephosphates,ALP)mRNA表达的影响进行研究，探讨其对成骨细胞MC3T3-E1的作用及作用机制，从而为探索痹祺胶囊能否治疗骨质疏松症提供一定的实验依据。1材料1.1试验药物痹祺胶囊原药粉末，由天津京万红药业股份有限公司提供(批号为301510),痹祺胶囊水提取物的制备:称取痹祺胶囊原药粉末：LOg,加入100mL超纯水室温超声提取lh,连续2次，合并提取液,4°C、12000rpm冷冻离心30min,合并上清液，・20°C冷冻8h,然后在冷冻干燥机内冷冻干燥，得到痹祺胶囊水提取物。1.2细胞株和试剂小鼠早期成骨细胞株MC3T3-E1,购自中国医学科学院基础医学研究所细胞库。含有L■谷氨酰胺、丙酮酸钠及Hepes配方的DMEM高糖培养基(干粉)，Sigma-Aldrich公司，美国，按照说明书用MilliQ级纯水配制并过滤除菌，2-8°C冷藏保存。1.3仪器C02细胞培养箱，Thermo,美国。多功能微孔板分析仪，FlexStation3,MolecularDevices公司，美国。Real-TimePCRSystem,Prism7500,AppliedBiosystemsInc公司，美国。冷冻干燥机，Thermo,美国。一次性针头式滤器，0・22μm孔径,Millipore公司，美国。细胞培养瓶，96孔、48孔、6孔细胞培养板，UV可透分析板，50mL离心管，Corning公司，美国。0・2mLPCR管，0.2mL8■联光学盖PCR管，1.5mL聚丙烯离心管，一次性无RNA酶无菌吸头，Axygen公司，美国。2方法2.1细胞培养MC3T3-E1细胞以含有L■谷氨酰胺、丙酮酸钠及Hepes配方的DMEM高糖液体培养基培养，添加100U·L-l青霉素，100μg·mL・l的链霉素，10%热灭活胎牛血清(HI-FBS)o培养于37°C、5%CO2、饱和湿度的培养箱内。细胞隔天换液。2.2成骨细胞鉴定矿化结节试验：用茜素红(ARS)法染色显示成骨细胞形成的矿化结节，以鉴定成骨细胞具有体外矿化的特性。2.3痹祺胶囊水提取物对BMP-2mRNA.ALPmRNA及0CmRNA表达的影响将MC3T3-E1细胞以每孔5.0×106个细胞种植到6孔细胞培养板，培养24h后换液，使细胞充分贴壁后随机分组，分为对照组及痹祺胶囊水提取物0.25,0.5,lg·L-l干预组。对照组换入无酚红DMEM培养基，痹祺胶囊水提取物0.25,0.5,lg·L-l干预组在培养基中分别给予相应浓度的痹祺胶囊水提取物。继续培养48h后，按试剂盒和反应体系的要求将总RNA经反转录成cDNA,设计特异性引物...
