β淀粉样蛋白对小胶质细胞合成一氧化氮的影响作者：韩笑峰吕丽葛汝丽唐荣华【摘要】目的探讨β淀粉样蛋白(amyloidbetapeptide,Aβ)诱导小胶质细胞活化后κ轻链核因子(nuclearfactorkappaB,NFκB)的表达及一氧化氮(NO)水平的变化。方法Aβ干预纯化培养的小胶质细胞，观察其形态学变化，采用镉还原法测定NO水平，免疫细胞化学方法研究NFκB的表达。结果500nmol/L及1000nmol/LAβ干预组细胞形态呈“阿米巴样”，细胞核内NFκB的表达增加（P＜0.05），培养基中NO浓度升高（P＜0.05）。结论Aβ激活小胶质细胞NFκB途径大量合成NO，可能参与阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)的致病过程。【关键词】β淀粉样蛋白小胶质细胞κ轻链核因子一氧化氮阿尔茨海默病【Abstract】ObjectiveTostudythemorphologicalchangesofmicroglialcellactivatedbyamyloidbetapeptide,theexpressionofnuclearfactorkappaBincreasedinnucleusandthelevelsofnitricoxideinculturalmedium.MethodsPurifiedmicroglialcellswereintervenedbyamyloidbetapeptideandthemorphologicalchangeswereobserved.Thecadmiumreductionmethodwasusedtodeterminethelevelsofnitricoxideinculturemedium,immunocytochemicalmethodtoinvestigatechangesofnuclearfactorkappaB.ResultsTherewerenostatisticalsignificantdifferencesbetweentheexperimentalgroupof100nmol/Lamyloidbetapeptideandthecontrolgroup(P＞0.05).Intheexperimentalgroupsof500nmol/Land1000nmol/Lamyloidbetapeptide,microglialcellswerebigger,theexpressionofnuclearfactorkappaBincreasedinnucleusandthelevelsofnitricoxidewerehigherinculturemediumthancontrolgroup(P＜0.05).ConclusionTheamyloidbetapeptidecouldparticipateintheprocessesofAlzheimer’sdiseasebyinducingmicroglialcellstoexcretenitricoxide.【Keywords】amyloidbetapeptide，microglialcell，nuclearfactorkappaB，nitricoxide，Alzheimer’sdisease阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)重要的病理特征之一是纤维状β淀粉样蛋白(amyloidbetapeptide,Aβ)在神经细胞外及脑血管壁沉积形成老年斑(senileplaques,SP)。大量研究表明，Aβ的沉积在AD发病中起着关键作用，但其神经损伤的具体机制尚不完全清楚，研究提示，一氧化氮(nitricoxide,NO)可能与Aβ的神经毒性有关。本研究用Aβ干预小胶质细胞，观测κ轻链核因子(nuclearfactorkappaB,NFκB)的表达以及NO水平的变化，探讨Aβ诱导小胶质细胞合成NO的机制。1材料和方法1.1材料1.1.1动物：出生3d内的Wistar大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。1.1.2试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清（购自Hyclone公司），Aβ140、Aβ142（购自SIGMA公司），胰蛋白酶、TritonX100（购自Amresco公司），小鼠抗大鼠CD11b单克隆抗体（购自Serotec公司），兔抗NFκBp65多克隆抗体（购自SANTACRUZ公司），抗小鼠及抗兔SP试剂盒和DAB显色试剂盒（均购自北京中山生物技术有限公司）。1.2方法1.2.1小胶质细胞分离、培养：在无菌条件下取出新生Wistar大鼠的大脑，剥离脑膜，取大脑皮层，剪成0.5mm3碎块，加入1ml0.125%胰蛋白酶室温消化，用100目不锈钢筛网过滤，离心，弃上清，加入DMEM/F12培养基重新悬浮细胞，接种于多聚赖氨酸包被的50ml培养瓶中，置于37℃、含5%CO2、20%O2饱和湿度的培养箱中培养。原代混合胶质细胞培养7～9d后，在37℃恒温摇床上以250r/min振速摇动处理2.5h，将细胞悬液接种到已放置盖玻片的培养皿中，37℃培养1h，弃未贴壁细胞，加新鲜培养基，培养5～7d即可使用。用免疫细胞化学方法标记其特异性抗原CD11b进行细胞纯度鉴定，小胶质细胞比例占90%以上即符合要求。1.2.2Aβ的“老化（aged）”：用无菌三蒸水将Ａβ稀释成0.5×105nmol/L，37℃孵育1周，使其变为聚集状态的Ａβ［１］。1.2.3小胶质细胞的干预：培养皿中分别加入不同浓度的“老化”Ａβ140或Ａβ142，对照组则不加Ａβ，继续培养24h。收集培养基，-80℃保存，备测定NO浓度。细胞爬片用甲醛固...